何宏涛， 王玉虎， 周洪友， 刘 颖， 赵明敏， 郑红丽

(1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010019； 2.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯 017010)

植物根际促生长细菌(pgpr)是存在于植物根际并促进植物生长的细菌。生物菌肥能促进土壤养分的释放，改善土壤结构，肥沃土壤，在植物根部大量生长繁殖，成为优势菌，产生屏障效应，增强植物的抗病性和抗逆性。同时，这些细菌的一些代谢产物可以促进植物的生长发育。已有研究表明，一些微生物能产生生长素(iaa)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)脱氨酶，乙烯生物合成的前体是acc，acc可被1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶降解，从而减少乙烯合成，在提高植物对非生物胁迫方面起到重要作用。 生长素调控着植物生长发育的各个方面，可以促进植物生长发育，调节光合作用等。还有一类微生物可以将土壤中的难溶性磷分解，转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，即解磷菌。

细菌产生长素功能于1979年首次被发现，后出现大量的关于生长素产生菌的报道，已有研究中发现，有多个菌属具有产生长素的特性。近年来，为了提高作物产量和品质，生产者在生产过程中大量使用化肥和农药，破坏土壤结构，降低土壤肥力，破坏生态环境。生物菌肥越来越受到人们的关注。植物根际促生菌对多种植物具有促生作用。刘涛等研究发现，从番茄组织及根际分离的细菌能促进番茄植株的生长。

本研究用不同培养基从番茄根际土壤中分离得到番茄优势细菌，从中筛选能高效分泌生长素、具有解磷作用、对番茄和马铃薯具有促生作用的细菌，以期为研制生物菌肥提供参考。

1.1.1 土壤样品 土壤样品于2021年4月21日采自内蒙古自治区呼和浩特市贺新草莓园(40.663 199°n，111.775 257°e)的番茄大田。采用五点式取样法，将番茄植株整株拔起，轻轻抖动根际土壤，并用毛刷轻轻刷下根表土壤，装袋、标号，带回实验室进行菌株分离。

1.1.2 培养基配制 lb培养基、阿须贝培养基、蒙金娜无机磷培养基、有机磷卵磷脂培养基、salkowski显色液、产蛋白酶培养基等的配制详情可见参考文献[11-13]。

1.2.1 根际土壤细菌的分离 根际土壤细菌的分离纯化：称取5 g土样置于装有玻璃珠的三角瓶中，加入45 ml水，在28 ℃160 r/min条件下摇动 30 min，静置10 min，得土悬液母液，分别稀释成10、10、10、10、10、10、10倍液，选择10、10、10、10倍液，涂在lb培养基上，每盘50 μl，每个梯度重复3次，根据外观、形态在28 ℃培养2～3 d后，挑出具有明显特征的菌落，纯化并在lb培养基中培养，将分离得到的所有来自番茄土壤中的细菌置于50%甘油中，于-80 ℃储存备用。

用无菌牙签挑取平板菌落在阿须贝无氮培养基上划线培养，28 ℃培养5 d观察有无菌落生长。

1.2.2 番茄根际土壤产生长素菌株的筛选 采用salkowski比色法，将纯化后的细菌接种于含有-色氨酸(100 mg/l)的lb液体培养基中，在摇床上以28 ℃、180 r/min培养2 d，取50 μl菌液滴于96孔板上，并添加50 μl salkowski比色液。同时加入-色氨酸培养基和无细菌比色液作为空白对照，加入含生长素的蒸馏水作为阳性对照，在黑暗中静置30 min。变红的菌株是产生生长素的菌株。

对具有产生生长素功能的菌株进行定量测定。36 h后，通过分光光度法测定上清液在450 nm处的吸光度，并通过标准曲线确定上清液中生长素的含量。采用分析纯的生长素绘制标准曲线。

1.2.3 番茄根际土壤细菌溶磷能力测定 分别在无机磷和有机磷卵磷脂培养基中接种产生长素的菌株。每株菌在28 ℃培养5 d，观察菌株周围是否有1个透明的圆圈，以判断其是否具有解磷的能力。并测量透明环直径()和菌落的直径()，并计算溶磷指数()。

1.2.4 产生长素菌株对番茄和马铃薯幼苗的促生作用 iaa产生菌对番茄幼苗促生作用测定方法：挑选饱满的种子浸种30 min，将滤纸片浸湿，放入干净的培养皿中，28 ℃放置1～2 d，挑选出芽的种子进行播种。播种后1周，挑选生长均匀的植株采用灌根法接种产生长素的7株菌(fqd13、fqd16、fqd32、fqd42、fqd47-2、fqd58-1、fqd59)，每组处理6次重复，以清水处理为空白对照，不产生长素的菌株4fqd6#为阴性对照。将菌株接种于lb培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养 2 d，进行灌根。每株番茄每10 d灌菌液10 ml，共3次。30 d后观察番茄植株生长情况，分别测定其株高、地上部分干质量以及鲜质量，分析不同产生长素菌株对番茄生长的影响。

iaa产生菌对马铃薯幼苗的促生作用测定方法：以产生长素浓度高的菌株fqd47-2及fqd13为供试菌株，研究其对马铃薯幼苗的促生作用。马铃薯播种于基质土中，出苗后7 d，挑选长势均匀的马铃薯采用灌根法接种菌液300 ml(菌液制备与番茄促生研究方法一致)，以清水处理为空白对照，lb培养基处理为阴性对照，每个处理6次重复，25 d后测量不同处理组植株的各项指标。

1.2.5 菌株fqd47-2产蛋白酶能力的测定 挑取少许菌落接种于蛋白酶筛选培养基，28 ℃培养 1 d 观察能否产生透明圈。

1.2.6 菌株fqd47-2的形态观察及生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》及已鉴定完成的菌株，对菌株进行生理生化鉴定，包括革兰氏染色、v—p试验、柠檬酸盐利用试验、丙酸盐利用试验、-木糖利用试验、-阿拉伯糖利用试验、-甘露醇利用试验、明胶液化、硝酸盐还原、淀粉水解等生理生化测定。

1.2.7 菌株fqd47-2的16s rdna基因序列测定及系统发育树构建 细菌全基因组序列提取试剂盒提取细菌dna后，采用细菌通用引物7f-1540r进行pcr扩增，反应体系(25 μl)为：r-0.125 μl、dntp 2 μl、10×buffer 2.5 μl、引物各 1 μl、dna模板1 μl、ddho补足，反应程序：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 40 s、34个循环，72 ℃ 10 min。对pcr产物进行电泳检测后，送去北京六合华大基因科技有限公司测序后得到拼接序列，通过与blast数据库中的所有序列进行核苷酸同源性比较，用mega 7.0构建系统发育树。

1.2.8 数据处理 采用spss 20.0进行单因素方差分析(=0.05)，graphpad prism 8对数据进行分析和作图。显著性差异采用不同字母表示。

采用间接分离法从番茄品种金妃根际土壤中分离得到79株细菌。在无氮培养基中划线培养，64株菌株能生长正常。

采用salkowski比色法测定64株在阿须贝培养基上能正常生长的细菌分泌的生长素含量。结果表明，64株细菌中有7株具有分泌生长素的能力，占总数的10.9%(图1)。由图2可知，不同菌株分泌的生长素含量不同。供试菌株产生长素含量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/ml之间。菌株fqd47-2分泌生长素的能力最强，为(15.64±0.14) μg/ml；菌株fqd58-1分泌生长素的能力最弱，为(2.55±0.08) μg/ml。

为进一步研究番茄根际菌株的溶磷能力，将7株番茄根限细菌用牙签点接于有机磷及无机磷培养基上，观察有无透明圈产生。结果表明，7株产生长素菌株在无机磷培养基上均无透明圈产生，5株菌株(fqd47-2、fqd13、fqd42、fqd16、fqd59)具有解有机磷能力(图3和表1)。

以分泌生长素的7株番茄根际细菌为供试菌株，采用温室盆栽方式，研究其对番茄幼苗的促生作用。从图4和图5可以看出，供试菌株对番茄幼苗有不同程度的促生作用。与空白对照相比，处理组fqd16、fqd47-2、fqd32、fqd58-1、fqd59、fqd42的番茄幼苗植株长势较好，显著高于空白对照(