曹超逸， 潘义宏， 冀新威， 黄 坤， 李柘锦， 张加研

(1.西南林业大学化学工程学院，云南昆明 650224； 2.云南省烟草公司红河州公司，云南弥勒 652300)

烤烟作为云南重要的经济作物，近年来由于耕地资源短缺、其他经济作物影响等导致种植区域不断压缩，连作现象愈加严重。长期连作的烟田土壤理化性状恶化、微生物群落结构失衡等，加剧了烤烟土传病害发生和降低了烟叶产质量，严重制约烟草产业可持续稳定发展。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，参与土壤中物质转化、养分循环利用等，对土壤肥力形成、土壤健康和生态稳定具有关键作用。研究表明，长期连作降低了土壤微生物结构和功能多样性，尤其土壤微生物功能多样性丰富度指数、香农指数等呈现降低趋势，且与轮作差异达到显著水平。土壤细菌群落连作5年后多样性和相对丰度开始降低，并随连作年限的延长，群落丰度、多样性和特有细菌数呈递减趋势；同时连作造成了土壤中病原真菌(被孢霉科、镰刀菌属、链格孢属等)增加，加上自毒物质积累，破坏了土壤微生态平衡，降低土壤功能，引起严重的连作障碍。

土壤微生物多样性可揭示土壤微生物群落的结构和功能的差异，尤其根际微生物与植株和周围土壤之间发生着各种关系，根际微生物的数量、种类等相互作用决定着烟株健康。目前，关于烟草连作对土壤微生物多样性的研究报道主要集中在土壤细菌群落和真菌群落多样性方面，而对于红壤烟区根际土壤微生物群落多样性、种群变化以及与连作年限相关性等方面的研究还较为欠缺。因此，笔者采用illumina miseq 高通量测序技术开展了云南省红河红壤烟区不同连作年限的烟田根际土壤微生物多样性研究，分析连作下根际土壤微生物群落丰度和结构组成多样性的变化，挖掘连作下根际红壤微生物功能和群落相关性，有助于进一步了解红河红壤烟区连作烟田根际土壤微生物变化特点，为该地区种植烤烟过程中的微生物调控以及栽培管理提供理论依据和实践指导，促进烤烟产业可持续发展。

试验于2019年在云南省红河州泸西县白水镇大孟泽村(103°30′e，24°46′n)开展，年平均气温15.2 ℃，海拔1 803 m，年平均降水量950 mm，植烟土壤为红壤，试验地块土壤基本理化性质如下：ph值为6.67，有机质含量为30.12 g/kg，全氮含量为1.42 g/kg，全磷含量为1.23 g/kg，全钾含量为 6.30 g/kg，速效氮含量为42.13 mg/kg，速效磷含量为51.46 g/kg，速效钾含量为479.68 g/kg。

在同一连片的地块，分别选取轮作(scr，种植烤烟前一年种植玉米)、连续种植烤烟2年(scc2)、3年(scc3)、4年(scc4)、5年(scc5)的地块，并以同连片地块撂荒3年地块为对照(sck)作为试验小区，每个小区3个重复，每个重复300株烤烟，连续种植烤烟地块烤烟收获后冬闲处理，次年连续种植烤烟。所有处理采用膜下小苗的移栽方法于同一天进行移栽，各处理纯氮用量统一为105 kg/hm，统一移栽时按75 kg/hm进行环施复合肥(n ∶po∶ko=12 ∶8 ∶25)，第1次追肥按30 kg/hm浇施复合肥(n ∶po∶ko=12 ∶8 ∶25)，第2次追肥按 150 kg/hm浇施硫酸钾(ko≥52%)。烤烟其他管理措施统一参照红河州烟草公司优质烟叶生产技术措施进行。

各处理统一于烤烟现蕾期参照smalla等的方法，将烤烟全株挖出，并将烟草根放入无菌袋中，用力摇晃，每个重复土样由3个土样组成。及时用冷藏箱将土壤带回实验室，剔除石块和烤烟残根等杂物后过1 mm筛，采用干冰保存的方式送样进行高通量测序。

使用powersoil dna isolation kit (qiagen，hilden，germany)试剂盒提取每个样品根际土壤总dna。用引物338f(5′-a c t c c t a c g g g a g g c a g c a-3′)、806r(5′-g g a c t a c h v g g g t w t c t a a t-3′)对土壤细菌16s rrna的v3-v4区域进行pcr扩增。用引物its1f(5′-c t t g g t c a t t t a g a g g a a g t a a-3′)和引物its2(5′-g c t g c g t t c t t c a t c g a t g c-3′)和对土壤真菌its区域进行pcr扩增。pcr扩增后，用pcr纯化试剂盒(omega，usa)纯化产物，在北京百迈客生物科技有限公司采用illumina hiseq 2500测序仪(illumina inc.，san diego，usa)进行高通量测序。

测序结束后，原始标记在重叠之后与flash合并。用trimmomatic(version 0.33)删除低质量标签，用uchime(version 4.1)删除嵌合物。将符合条件的序列以97%的相似度划分到操作分类单元(otu)中。高通量测序数据的图由r软件生成(version 2.15.3)。采用qiime 软件(version 1.7)进行主成分(pcoa)分析，spss 21.0 进行相关性分析和方差分析。

2.1.1 根际土壤细菌群落α多样性分析 通过对不同种植年限烤烟根际土壤细菌α多样性进行分析发现，随着种植年限的延长，烤烟根际土壤细菌群落α多样性呈升高—降低—升高—降低趋势(图1-a)。与sck(撂荒地)相比，种植1年(scr)烤烟ace、chao1、shannon指数升高，种植2年(scc2)、种植3年(scc3)烤烟的ace、chao1、shannon指数下降，种植4年(scc4)ace、chao1、shannon指数上升，种植5年(scc5)后的ace、chao1、shannon指数有呈下降趋势。

从ace指数来看(图1-b)，种植1年(scr)烤烟的ace显著高于撂荒地(sck)、scc2、scc3、scc5(0.05)。从chao1指数来看(图1-c)，scr处理chao1显著高于sck、scc2、scc5(0.05)。

2.1.2 根际土壤真菌α多样性分析 对不同种植年限烤烟根际土壤真菌α多样性进行分析发现，随着种植年限的延长，烤烟根际土壤真菌群落呈波动变化，ace、chao1指数呈升高—降低—升高—降低趋势，shannon指数呈降低—升高—降低趋势(图2-a)。其中sck的ace、chao1指数最低，shannon指数最高。随着种植年限延长，scr处理土壤的ace、chao1升高，shannon指数降低，scc2、scc3处理土壤的3个指数均持续下降，scc4处理土壤的3个指数均上升，但scc5处理土壤的3个指数均呈下降趋势。

从ace指数来看(图2-b)，scc4的ace指数最高，显著高于scc5和scc2(