黄启超， 顾琼楠， 褚世海， 陈安安， 李 林， 李儒海， 孙正祥

(1.长江大学农学院，湖北荆州 434025； 2.湖北省农业科学院植保土肥研究所/农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室，湖北武汉 430064)

稗属(beauv.)杂草是我国稻田恶性杂草之一，严重制约了我国水稻产量。目前，针对稻田稗属杂草主要以化学防治为主，国内用于防治稻田稗属杂草的除草剂主要有五氟磺草胺、乙草胺、丁草胺、丙草胺、二氯喹啉酸、双草醚、氰氟草酯等，其中三唑并嘧啶磺酰胺类的五氟磺草胺是目前较常用的除稗剂。五氟磺草胺是乙酰乳酸合成酶(als)抑制剂，由美国陶氏益农公司研发，于2008年进入我国市场，因其良好的除稗草效果而得到广泛推广使用。近年来，由于五氟磺草胺的长期单一使用导致多地稗草对其产生抗性，其中以湖北省稗草高水平抗性比例最高。2018年，马国兰等对我国7省共70个地区的稻田稗属杂草进行了五氟磺草胺抗性检测，结果表明50%地区稗属杂草对五氟磺草胺达到了高抗水平，47.1%地区稗属杂草对五氟磺草胺达到了中抗水平，抵抗水平稗属杂草地区只有2.9%，所有地区均无敏感稗属种群；其中，湖北、安徽、宁夏和黑龙江等4个省份的高水平抗性稗属种群发生情况最为严重。

杂草抗性机制主要包括靶标抗性机制和非靶标抗性机制，靶标抗性机制一般与相关靶标基因突变或过量表达有关，靶标基因的突变造成相关靶标蛋白3d结构或者电化学性质改变，导致靶标酶与除草剂亲和度降低，而靶标基因过量表达导致靶标酶含量提高，从而补偿除草剂的抑制；非靶标抗性的作用机制主要包括杂草对除草剂的解毒代谢增强、渗透减弱、吸收减少、传导变缓及屏蔽作用等。目前已报道的杂草als抗性突变位点有9个，其中已报道的稗属杂草als氨基酸序列抗性突变位点有ala-122、pro-197、ala-205、phe-206、asp-376和trp-574等，这6个位点的突变均使得稗属杂草对als抑制剂类除草剂产生了抗性。例如，fang等发现稗(-)ala-122-val和ala-205-gly等2种靶标位点突变生物型均对五氟磺草胺产生了抗性，且2个突变型稗als离体活性均高于敏感种群。此外，fang等还发现了抗五氟磺草胺稗als氨基酸序列phe-206-leu突变型，且该突变位点是1处新的als突变位点。yang等在研究稗对五氟磺草胺和氰氟草酯的抗性机制中发现，稗trp-574-leu突变生物型对五氟磺草胺的抗性指数为65.84倍。liu等发现了水稗()als2氨基酸序列拷贝pro-197-ser突变型，且该突变型水稗对部分als抑制剂产生了交互抗性，同时als离体活性比敏感种群高13.7倍。此外，2021年，l?bmann等首次发现并报道了稗als氨基酸序列中376位天门冬氨酸(asp)突变成了谷氨酸(glu)。dalazen等在研究咪唑乙烟酸对稗降解增强相关基因差异表达的影响中发现，抗咪唑乙烟酸稗生物型细胞色素p450酶和谷胱甘肽s转移酶相关基因表达量均高于敏感种群，但基因表达量与敏感种群差异不显著，可能由非靶标抗性机制主导。

关于湖北省稗种群对五氟磺草胺靶标抗性机制的研究鲜有报道，目前仅在湖北省荆州市公安县发现als氨基酸序列trp-574-leu突变型稗。本研究拟通过测定稗18-wjj-ec种群对五氟磺草胺的敏感性及抗性机制，明确稗18-wjj-ec种群的抗性水平及靶标抗性机制，以期为湖北省稻田抗性稗的防除治理提供理论基础。

供试植物：抗性稗于2018年9月采自湖北省武汉市江夏区金水试验农场水稻田；敏感型稗18-nj种子由江苏省农业科学院植物保护研究所李永丰课题组提供。

供试药剂和试剂主要有25 g/l五氟磺草胺乳油[陶氏益农农业科技(江苏)有限公司]、97.1%五氟磺草胺原药(安徽星宇化工有限公司)、焦磷酸硫胺素(tpp，北京索莱宝科技有限公司)、黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐(fad，上海麦克林生化科技有限公司)、1-萘酚(上海麦克林生化科技有限公司)、肌酸(国药集团化学试剂有限公司)、乙偶姻(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、nuclean plant genomic dna kit(江苏康为世纪生物科技有限公司)、cycle-pure kit(美国omega bio-tek公司)；tr251-50小量rna提取试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)、itaptm universal sybr? green supermix(美国bio-rad laboratories公司)、5× all-in-one mastermix(加拿大applied biological materials inc公司)、zero background ptopo-ta(北京艾德莱生物科技有限公司)、trans 5α chemically competent cell(上海唯地生物技术有限公司)、phanta? max super-fidelity dna polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

仪器设备主要有optima xpn-100超高速冷冻离心机(美国beckman coulter公司)、东胜etc811 pcr 扩增仪(北京东胜创新生物科技有限公司)、 eppendorf centrifuge 5810r冷冻离心机(德国eppendorf 公司)、bio-rad cfx connect荧光定时定量pcr仪(美国bio-rad公司)、biotek epoch酶标仪(美国biotek公司)、lac-400-n人工气候箱(上海龙跃仪器设备有限公司)。

1.2.1 剂量反应曲线测定 参照ny/t 1155.4—2006农药室内生物测定试验准则，将抗性稗18-wjj-ec种群和敏感稗18-nj种群种子浸泡在100 mg/l赤霉酸溶液中，并于27 ℃光照培养箱中催芽24 h，然后分别播种在直径15 cm塑料盆(含4/5基质土)中，每盆50粒，均匀覆土1 cm，置于温室内培养，培养条件为白天温度 (27±5) ℃，夜间温度(20±5) ℃，相对湿度(75±5)%，自然光培养。稗2～3叶期时，每盆保留长势一致植株20株，待稗3叶1心时期，对抗性稗18-wjj-ec种群茎叶喷施4、8、16、32、64、128、256、512 g a.i./hm共8个浓度的五氟磺草胺，敏感稗 18-nj 种群茎叶喷施五氟磺草胺浓度梯度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 g a.i./hm，以清水处理作为对照，每个处理4个重复，施药21 d后测量每盆稗地上部分鲜质量。

1.2.2 稗基因序列测定 将稗18-wjj-ec种群和18-nj种群种子分别播种在10 cm×10 cm×10 cm的塑料方盒中，于28 ℃，光暗1 ∶1，3 000 lx人工气候箱中培养至3叶1心期，以五氟磺草胺田间推荐剂量高量30 g a.i/hm茎叶喷施处理稗18-wjj-ec种群，稗18-nj种群不处理，14 d后取存活稗幼嫩组织，采用nuclean plant genomic dna kit提取稗总dna，每个种群提取10棵稗单株总dna。根据ncbi登录的稗基因序列，采用primer premier 5.0设计稗基因全长扩增引物序列(上游引物：5′-g t c a t c g c c a a c c a c c t c t t c c-3′，下游引物：5′-c t g c c a t c a c c a t c c a g g a t c-3′)。pcr反应体系：dna模板1 μl；2×phanta max buffer 12.5 μl；dntp mix 0.5 μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.5 μl；10 μmol/l上、下游引物各1 μl；dd ho补足至25 μl。pcr反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，63 ℃ 退火50 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。pcr产物经凝胶电泳鉴定后，用cycle-pure kit(omega bio-tek公司)进行产物纯化回收，回收产物经过连接、转化、克隆至ptopo vector，37 ℃恒温培养12 h后，每个dna样本挑取10个单克隆菌株培养扩繁，新鲜菌液经pcr扩增及凝胶电泳鉴定后送至湖北武汉擎科生物科技有限公司进行双向测序拼接。所测序列结果经blast比对验证后，用dnaman6.0软件进行比对分析。

1.2.3 稗als活性测定 采用yu等的方法进行测定，按“1.2.2”节方法培养稗至3叶1心期，每个种群取幼嫩叶片3.0 g，液氮下研磨成细粉，准确称量2.0 g细粉转入离心管中，加入16 ml酶提取液(含10 mmol/l丙酮酸钠，0.5 mmol/l mgcl，0.5 mmol/l tpp，10 μmol/l fad的0.1 mol/l ph值为 7.5的磷酸缓冲液)，混匀后冰上放置10 min，用2层尼龙网纱布过滤，滤液于27 000、4 ℃下离心20 min，将上清液转入新离心管中，缓慢加入硫酸铵晶体(每1 ml粗酶液加0.313 g硫酸铵晶体)，缓慢搅拌20 min，于27 000、4 ℃下离心 20 min，弃上清液，沉淀加入4.5 ml酶反应液(含200 mmol/l丙酮酸钠，20 mmol/l mgcl，2 mmol/l tpp，20 μmol/l fad的0.05 mol/l ph值为 7.5的磷酸缓冲液)充分溶解得到粗酶液，并置于冰上备用。于1.5 ml离心管中，分别加入100 μl上述粗酶液和100 μl以 0.05 mol/l ph值7.5磷酸缓冲液配制的五氟磺草胺溶液(浓度梯度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1 000.00 μmol/l)，充分混匀后37 ℃水浴暗反应1 h，加入8 μl 6 mol/l hso，60 ℃水浴脱羧15 min终止反应，然后加入5.5% 1-萘酚(以2.5 mol/l naoh配制)和0.55%肌酸各190 μl，60 ℃水浴显色15 min，冰浴1 min后低速离心，取200 μl上清液加入96孔酶标板中，测定值，以100 μl磷酸缓冲液代替五氟磺草胺作为空白对照，以提前加入8 μl 6 mol/l hso的酶液作为背景对照。试验生物学重复2次，技术重复3次。以乙偶姻制作标准曲线，将反应液值换算成乙偶姻含量，计算五氟磺草胺对各种群稗离体als抑制中浓度(ed)，并计算抗性指数()。

1.2.4 稗基因表达量测定 按“1.2.2”节方法培养稗至3叶1心期，以五氟磺草胺田间推荐剂量低剂量15 g a.i./hm茎叶喷雾处理，采用trizol法，用tr251-50小量rna提取试剂盒提取施药前和施药后1、3、5、7 d稗单株总rna，用 5× all-in-one rt master mix反转录成cdna后，采用bio-rad cfx connect荧光定时定量pcr仪进行稗基因相对表达量测定，以稗基因为模板设计rt-qpcr扩增引物(上游引物qals-f：5′-a t c c g c a t t g a g a a c c t c c-3′，下游引物 qals-r：5′-t c t t c t t g a t t g c t g c a c g t-3′)，以肌动蛋白actin作为内参基因(上游引物act-f：5′-c a c a c t g g t g t c a t g g t a g g-3′，下游引物act-r：5′-a g a a a g t g t g a t g c c a g a t-3′)，采用2-ΔΔ法以敏感稗18-nj种群未用药处理组作为对照组，分析计算稗基因相对表达量，试验生物学重复2次，技术重复3次。

所有数据经excel处理后，采用sigmaplot 14.0软件logistic模型计算五氟磺草胺对各稗种群的抑制中浓度(ed)，拟合方程如式(1)：

(1)

式中：表示除草剂剂量；为药剂处理与空白对照百分比；为斜率；为剂量反应下限；为剂量反应上限。

抗性指数按公式(2)计算：

(2)

式中：为抗性指数；为抗性生物型的抑制中浓度；为敏感生物型的抑制中浓度。

抗性水平分级标准：敏感：≤2；低抗：2