梁倩蓉，郑天伦，陈小明，朱凝瑜，郑晓叶，何润真，曹飞飞，薛辉利，丁雪燕

(浙江省水产技术推广总站 浙江省渔业检验检测与疫病防控中心，浙江 杭州 310023)

中华鳖()是我国南方重要的名特水产养殖品种之一，广泛养殖于浙江、广东、湖南等地，因具有较高营养价值和经济价值，深受消费者和养殖户青睐。中华鳖摄食营养需求主要包括碳水化合物、蛋白质、脂类、维生素和矿物质等，对饲料蛋白水平尤其是动物蛋白要求较高。目前中华鳖饲料仍较依赖进口鱼粉作为其蛋白来源，进口鱼粉也将成为制约其养殖发展的一大重要因素。受各种因素影响进口鱼粉价格居高不下，鱼粉替代方面的研究将逐渐成为热门研究课题。

昆虫繁殖速度快、食性广泛、食物转化率高，且饲养空间小，营养丰富，是缓解和改善饲料中动物性蛋白的重要蛋白质资源。蝇蛆是一种优质的动物蛋白源，不仅蛋白含量高(干蛆粗蛋白含量可高达60%以上)，含有丰富的矿物质和维生素，同时其体内含有抗菌肽、几丁质和凝集素等具有免疫调节功能的物质，是饲料中动物性蛋白的良好替代物，但作为免疫增强剂在水产动物中的应用研究仍较少。转录组测序可快速全面获取某一物种生物组织或细胞在某一状态下几乎所有转录本和基因序列的集合，基于大数据统计分析可揭示特定的生物学过程，目前已被广泛用于识别许多水生动物对环境或致病性应激源响应的关键基因和通路，有助于了解深层的应答机制。转录组测序技术目前已应用于中华鳖的相关研究，包括脂多糖刺激下的肠道分子免疫反应、杂交鳖与亲本免疫和生长差异基因表达、在急性冷胁迫下生理和免疫反应，以及感染出血性综合征病毒(tshsv)后中华鳖肺组织发生的免疫应答，而鲜有研究报道基于转录组测序技术分析蝇蛆蛋白作为免疫调节剂添加饲料后对中华鳖免疫代谢应答的影响和作用。

本研究对投喂不同含量蝇蛆蛋白添加饲料后中华鳖存活率和平均体增重率进行统计，测定血清6种常见非特异性免疫酶活性，利用转录组测序技术比较投喂蝇蛆蛋白添加饲料后中华鳖免疫代谢相关基因差异转录表达情况，拟从存活率、体增重率、非特异性免疫酶活性、基因表达等多方面揭示蝇蛆蛋白作为饲料添加剂对中华鳖免疫和代谢系统的影响变化和潜在机理，以期为蝇蛆蛋白作为中华鳖饲料添加剂有效性评价提供数据支撑。

1.1.1 蝇蛆蛋白添加饲料制备

无菌蝇蛆蛋白粉由浙江省农业科学院朱凤香课题组提供。常规饲料配方：鱼粉36%、膨化大豆2%、发酵豆粕32%、酵母4%、淀粉22%、多维元素1.2%、多矿元素1.2%、磷酸氢二钙1.2%、氯化胆碱0.4%。

将蝇蛆蛋白粉与中华鳖常规粉状饲料分别按质量比5∶95和10∶90进行混合，做成软颗粒饲料用于中华鳖饲养实验。

1.1.2 动物饲养

实验用中华鳖稚鳖900只，平均体重(20±2)g，由湖州德清一家省级中华鳖良种场繁育，放置在25 ℃水泥池中驯化暂养1周。

1.2.1 实验养殖和样品采集

将900只中华鳖随机均等分为常规饲料组(g1)、5%蝇蛆蛋白添加饲料组(g2)和10%蝇蛆蛋白添加饲料组(g3)，每组300只。在相同实验环境条件下，分别饲喂相应饲料(投喂量为甲鱼体重的2%)，3个月后统计存活率，并称量体重，计算平均体增重率。重复3次，计算公式如下：

存活率(%)=100×试验结束中华鳖数/试验初始中华鳖数；

平均体增重率(%)=100×(试验结束鳖均重-试验初始鳖均重)/试验鳖初均重。

3个投喂组每组随机选取5只中华鳖，处死后采血制备混合血清用于测定非特异性免疫酶活性，并将肝样品分别混合保存于液氮中用于转录组测序和实时荧光定量pcr(qrt-pcr)，其中，非特异性免疫酶活性送南京建成生物工程研究所测定，转录组测序送杭州联川生物技术股份有限公司分析。

1.2.2 测序、基因组装与注释

实验流程按照illumina公司提供的标准严格执行。肝总rna使用trizol试剂(invitrogen，美国)按照操作说明书提取，经bioanalyzer 2100和rna 1000 nano labchip试剂盒(agilent，美国)质检合格后，使用连接有oligo(dt)的磁珠富集真核生物mrna。以富集的mrna随机打断成的短片段为模板，用6碱基随机引物合成一链cdna，随后rnaseh和dna聚合酶Ⅰ进行二链cdna合成。ampure xp磁珠纯化双链产物，t4 dna聚合酶和klenow dna聚合酶修复黏性末端，3′末端加碱基a并加接头，磁珠选择片段后用user酶降解含有u的cdna第二链，进行pcr扩增获得最终测序文库。文库质检合格后采用illumina hiseq4000平台进行测序，测序读长为双端2×150 bp。

使用cutadapt去除测序接头，fqtrim过滤掉不合格的序列后得到有效数据，用fastqc软件获取测序结果，并进行综合评价，质量符合要求的测序数据用于trinity 2.4.0进行基因组装，去冗余去重复得到高质量的unigene。选取美国国家生物技术信息中心非冗余蛋白数据库(ncbi_nr：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，基因本体论数据库(go：http：//www.geneontology.org)，京都基因和基因组百科全书(kegg： http：//www.genome.jp/kegg/)，蛋白质家族数据库(pfam：http：//pfam.xfam.org/)，瑞士蛋白质序列数据库(swissprot：http：//www.expasy.ch/sprot/)，直系同源蛋白分组比对数据库(eggnog：http：//eggnogdb.embl.de/)，利用diamond软件对unigene进行相应的功能注释(e-value1或log2 (fold change)