何 秀，徐美余，辛维岗，张棋麟，王 峰，林连兵，*

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校饲用抗生素替代技术工程研究中心，云南 昆明 650500)

青贮饲料是通过在细碎的青绿植物中添加益生菌进行密封发酵得到的一种能长期保存的饲料。青贮发酵不仅能延长饲料的保存时间，还避免了秸秆焚烧带来的环境污染，青贮后的饲料具有适口性好和营养丰富等特点。随着我国畜牧业的迅速发展，青贮原料也逐渐多样化。近年来，青贮饲料的研究主要集中于青贮的原料、添加剂、微生物发酵和防腐措施等方面。甜象草()是近年来普遍流行使用的饲用牧草，具有低成本高收益的优势，不仅糖分含量高，其汁液也鲜嫩可口。研究表明，用甜象草与猪饲料混合饲喂可使土肥猪肉质风味得到改善。赖大伟等、王玉麒等研究表明，甜象草能促进肉牛的增重，提高奶牛的泌乳量，是饲喂的最佳粗饲料。因此，在养殖畜牧业的发展中甜象草作为优质饲用牧草具有广阔的应用前景。

因甜象草所携带的乳酸菌等有益菌群在发酵初期不占据优势，可能导致饲料腐败变质，加剧营养成分的流失。复合乳酸菌菌剂的添加可增加乳酸菌数量，促进乳酸发酵，降低饲料中的ph值，抑制有害菌群的增长，提高饲料的安全性。乳酸菌的添加能提高青贮料的乳酸含量和消化率，保证青贮料的发酵品质。复合菌剂的添加不仅可以改善青贮品质，还能缩短青贮发酵周期，降低养殖成本。除此之外，甜象草收割后含水量较高，碳水化合物含量少，不宜单独青贮，一般通过添加碾碎的谷物来改善饲料营养和发酵品质，豆粕的蛋白质和氨基酸含量较高，是青贮饲料的常用辅料。因此，本研究以豆粕为氮源补充原料，以期提高青贮发酵品质，从而获得高质量畜禽食品。

青贮饲料的品质由青贮过程中微生物菌群的演绎变化和最终的发酵产物共同决定。目前，有关甜象草青贮发酵饲料的研究较少，主要集中在甜象草的饲喂效果和与其他秸秆原料混合青贮后的发酵品质等方面，关于豆粕的添加和发酵时间对甜象草青贮的相关研究尚未有报道。因此，本研究主要以甜象草为主要原料，在复合菌剂和玉米粉的基础上添加豆粕，以探究豆粕的添加与发酵时间对甜象草青贮饲料的发酵品质和细菌多样性的影响，以期为畜牧养殖业提供优质的甜象草青贮饲料，促进无抗养殖更好发展。

玉米粉和豆粕购买于云南昆明某农贸市场。所用复合菌剂由唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、福莱乳杆菌组成(每种乳酸菌的活菌数均控制在1×10cfu·ml，喷雾干燥后按1∶1∶1∶1∶1配比备用)，菌种均分离于昆明理工大学生命科学与技术学院噬菌体与肠道微生物课题组提供的植物酵素。甜象草由云南省饲用抗生素替代工程研究中心种植基地种植并提供，9月份收割时原料的含水量约80%。

本试验设计以甜象草为发酵原料，参照高晓梅等研究中的组方二，并在此基础上略有改动。两组饲料配方均以100 kg为总量且以80 kg发酵原料(甜象草68 kg、玉米粉10 kg、复合菌粉2 kg)为基础，在此基础上hsl饲料添加20 kg豆粕作为试验组，lsl饲料添加20 kg甜象草作为对照组。甜象草收割后晾晒1 d，将菌粉溶解后喷洒在原料上，充分混匀后分装入青贮袋中，压实后用封口机密封，每组设置3个生物学重复，于室温(约22 ℃)发酵60 d。

1.3.1 感官评定

每10 d采集饲料样品进行感官评定，参照德国农业协会颁布的青贮饲料感官评定标准进行评价。

1.3.2 水分含量与ph值测定

每10 d采集饲料样品。称取10 g放入水分含量测定仪中进行水分含量的测定。另取10 g青贮饲料于200 ml广口三角锥形瓶中，加入90 ml水，于4 ℃冰箱浸泡24 h；用4层纱布过滤后，测定ph值。

1.3.3 养分含量测定

在10、30、60 d采集饲料样品。通过马弗炉-干法灰化法测定粗灰分(ash)；苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(ammonia nitrogen，an)；凯氏法测定粗蛋白质含量(crude protein，cp)和总氮含量(total nitrogen，tn)；范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，ndf)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，adf)含量。

1.3.4 有机酸含量的测定

处理方法参照文献[21]，具体如下：在10、30、60 d取10 g青贮饲料于200 ml广口三角锥形瓶中，加90 ml水，4 ℃冰箱中浸泡24 h，期间摇晃4次以上，取80 ml抽滤的液体，浓缩至20 ml后，置于150 ml碘量瓶中，加入50 ml 12.5%硫酸甲醇溶液，混匀后置入30 ℃，150 r·min恒温摇床中酯化24 h，在3 000×离心5 min。取上清液150 ml，用20 ml二氯甲烷萃取3次，合并萃取液；加入20 ml饱和氯化钠溶液洗涤3次，加入10 g无水硫酸钠静置过夜。滤出硫酸钠，用gc-ms仪器测定有机酸含量。

1.4.1 dna的提取与pcr扩增

在10、30、60 d取青贮饲料样品10 g，浸泡在90 ml 0.85% naci溶液中，150 r·min振荡2 h后，用4层纱布过滤，5 000×转速下离心20 min，收集菌体沉淀，存放于-20 ℃冰箱，用e.z.n.a.soil dna kit试剂盒提取青贮饲料中细菌的总dna。用引物338f(5′-actcctacgggaggcagcag-3′)和806r(5′-ggactachvgggtwtctaat-3′)对16s rrna基因v3-v4可变区进行pcr扩增，扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27个循环；72 ℃ 10 min。反应体系为：5×transstart fastpfu缓冲液4 μl，2.5 mmol·ldntps 2μl，上下游引物各0.8 μl，transstart fastpfu dna聚合酶0.4 μl，模板dna 10 ng，补足至20 μl。每个样本3个重复。

1.4.2 数据统计

使用nextflex rapid dna-seq kit建库，利用illumina公司的miseq pe300/novaseq pe250平台测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。用fastp软件质控后，用flash软件拼接；在uparse软件中，根据97%的相似度对序列进行operational taxonomic unit (otu)聚类。

采用spss(ibm spss 26)软件对lsl饲料和hsl饲料同一指标进行检验，对同一种饲料不同时间点数据进行单因素方差分析，并采用duncan氏法进行多重比较。微生物相对丰度和物种组成分析采用uparse软件在美吉生物平台进行。结果以平均值±标准差表示，以