王丽芳，叶 良，谢忠稳，党向利，*

(安徽农业大学 a. 园艺学院；b. 植物保护学院；c. 茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036)

随着抗生素和化学防腐剂被过度依赖和广泛使用，菌株耐药性、环境安全和食品安全等问题不断加重，寻找新的抗菌资源已成为研究焦点。为了应对以上问题，研究人员利用各种技术对植物、动物和微生物进行新型抗菌药物研发。抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是一类潜力巨大的新型抗菌药物和食品防腐保鲜剂，它是一类小分子肽类生物活性物质，对细菌、真菌、病毒和原虫等具有抑杀效果，广泛存在于各种生物体内，在天然防御系统中起重要作用。与传统抗生素相比，抗菌肽具有广谱抗菌、高效性和快速杀菌等优点，对正常的哺乳动物细胞无毒性，极少诱发抗性产生，多数抗菌肽的水溶性较好，热稳定性好，对较大离子强度、较低或较高ph值都有较强的耐受性。

目前有3种途径获取抗菌肽：分离纯化、化学合成和生物工程(重组技术)。生物工程存在不能正确转录而导致蛋白质折叠不准确等问题，化学合成则受到合成起始点基础结构的限制；而从植物、动物和微生物中提取的抗菌肽具有来源丰富、产物天然等优点，倍受科研工作者的青睐。植物可以在含有较多病原物的多种环境中存活，除了依靠细胞壁的物理性防御、启动过敏防御反应这两种防御机制外，还依赖植物抗菌肽。植物抗菌肽是非特异性寄主防御系统的组成部分，对多种微生物都有抑制或杀伤作用。

茶叶从最初的药用到如今作为饮料，已经被人类利用了上千年。流行病学调查和现代药理学研究均表明，饮茶对人体健康具有积极作用，茶叶在抗衰老、抗氧化、抗血脂、抗菌、抗过敏、抗辐射等方面具有重要作用。茶叶的抗氧化和抑菌活性在食品工业和医学上有着重要前景。冷却肉由于其营养价值高、卫生、新鲜等优点逐渐被消费者所青睐。冷却肉保鲜剂可分为化学保鲜剂和天然保鲜剂两大类。化学保鲜剂具有较好的防腐保鲜效果，但长期摄入会危害人体健康；天然保鲜剂由于其来源丰富、安全高效、抑菌谱广等优点，逐渐成为冷却肉保鲜剂研究开发的热点。

国内外学者已经从植物中发现了许多具有新颖结构的抑菌活性物质，比如皂苷、生物碱类、芳香类、甾体类、酚类和酚酸类等。从植物中分离纯化的植物抗菌肽也有研究，但未见从茶叶中分离、提取抗菌肽及其应用的报道。本研究以龙井茶叶为材料，提取茶叶抗菌肽粗提物，对茶叶抗菌肽粗提物的抑菌活性进行检测，对其作用机制进行分析。并将茶叶抗菌肽粗提物应用于冷却肉的防腐保鲜，以期为冷却肉等食品保鲜提供一种新的保鲜途径。

龙井茶叶为市售。乳酸链球菌素(nisin)，洛阳奇泓生物有限公司。磷钼酸测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。新鲜冷却肉购于沃尔玛超市(合肥)。所有试剂如无特殊说明，均采购自国药集团化学试剂有限公司。

金黄色葡萄球菌()和大肠埃希菌()购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，使用luria-bertani(lb)培养基(蛋白胨10 g·l、酵母粉5 g·l、nacl 10 g·l)在37 ℃培养。

蛋白提取液：0.7 mol·l蔗糖、0.1 mol·lnacl、0.5 mol·ltris-hcl (ph值7.5)、50 mmol·ledta-2na、质量分数0.2%二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)、质量分数0.1%苯甲基磺酰氟。

利用tris-丙酮-酚植物蛋白提取、热处理和超滤处理方法提取茶叶抗菌肽粗提物，具体方法如下。

(1)称取龙井茶茶叶10 g，加入40 ml蛋白提取液，匀浆研磨；(2)补充蛋白提取液至100 ml，加入100 ml tris平衡酚饱和溶液(ph值8.0)，4 ℃混合30 min；(3)4 ℃ 5 000×离心30 min，收集上清，加入5倍体积预冷0.1 mol·l醋酸铵-甲醇溶液，-20 ℃过夜沉淀茶叶中的蛋白质；(4)4 ℃ 12 000×离心10 min，收集沉淀，加入5倍体积预冷甲醇清洗；混合后在4 ℃ 12 000×离心10 min，收集沉淀，重复1次；以丙酮代替甲醇重复上述步骤2遍；4 ℃ 12 000×离心10 min，收集沉淀；(5)沉淀冷冻干燥后溶解于100 ml无菌水中，95 ℃水浴加热5 min，然后在室温12 000×离心10 min，取上清；(6)将上清转移至10 ku超滤离心管，4 ℃，12 000×离心15 min，收集滤过液。滤过液转移到3 ku超滤离心管中，同样条件离心15 min，收集滤过液，滤过液即为提取茶叶抗菌肽粗提物(tea amp extraction，tae)。

利用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)检测提取的茶叶抗菌肽成分。将8 μl样本与2 μl上样缓冲液混合后95 ℃水浴加热5 min，按顺序点在点样孔中。浓缩胶(质量分数5%)电泳电压80 v，待电泳到分离胶(质量分数12%)后将电压调至120 v直至跑至胶底部。电泳结束后将凝胶加入到质量分数0.1%考马斯亮蓝染色液中，待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液，振荡过夜脱色并拍照。

用二喹啉甲酸(bca)法检测茶叶抗菌肽粗提物浓度。利用无菌水配制不同浓度牛血清白蛋白(bsa)标准液(0、0.025、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·ml)，制作标准曲线。取100 μl茶叶抗菌肽粗提物，加入2 ml bca工作液(100 ml 1% bca-2na，2 ml 4% cuso)，37 ℃孵育30 min，检测其在562 nm的吸光度，依据标准曲线计算样品蛋白质浓度。

向水解管中加入100 μl茶叶抗菌肽粗提物与1 ml 6 mol·lhcl，充满氮气并封管，置于105 ℃烘箱中水解22 h。用娃哈哈纯净水将水解后的样品定容至5 ml，取2 ml于60 ℃真空干燥箱中干燥。加入1 ml hcl(0.02 mol·l)复溶，用0.22 μm的水膜过滤器过滤后，取20 μl参照lu等的方法利用日立l-8900高速氨基酸分析仪测定氨基酸含量。

通过平板抑菌圈法测定茶叶抗菌肽粗提物对细菌的抑菌活性。将对数生长期金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌稀释成为0.3的菌悬液。取无菌lb固体培养基20 ml冷却至50 ℃，加入30 μl为0.3的菌悬液，摇匀后倒入直径9 cm的培养皿中，待培养基凝固后在平板上打孔(4 mm)，每孔加入100 μl茶叶抗菌肽(100 μg·ml)。待样品完全扩散到平板后37 ℃倒置培养24 h，观察并测量抑菌圈直径，重复3次。阳性对照为同等浓度的乳酸链球菌肽(nisin)，阴性对照为无菌水。

选用金黄色葡萄球菌检测茶叶抗菌肽粗提物对细菌细胞膜渗透率的影响。膜渗透率的测定根据dang等的方法进行。用10 mmol·l磷酸盐缓冲液(pbs)将对数生长期细菌稀释至终浓度为10cfu·ml的菌悬液。分别用终浓度为100 μg·ml的抗菌肽粗提物和nisin处理菌悬液，37 ℃分别培养0、0.5、1、2、4、8 h。阴性对照(ck)为pbs，阳性对照为2 mg·ml的triton x-100。用0.22 μm水系针筒过滤器过滤菌液，收集滤液。测量滤液在260 nm的吸光度，用下述公式计算细菌细胞膜渗透率：

细胞膜渗透率(%)=(-)/(-)×100。

(1)

式(1)中：为茶叶抗菌肽粗提物处理的吸光度，为pbs处理的吸光度，为triton x-100处理的吸光度。

用灭菌的质量分数0.9% nacl溶液将对数生长期金黄色葡萄球菌稀释至浓度为10cfu·ml的菌悬液。用终浓度为100 μg·ml的茶叶抗菌肽粗提物处理菌悬液，37 ℃分别培养0、2、4、8 h。阴性对照(ck)为无菌水，nisin为阳性对照。将孵育后的菌液1 000×g 离心10 min，取上清，按照磷钼酸测定试剂盒说明测定细菌上清中细胞外泄的磷离子浓度。用下列公式计算磷离子浓度。

磷离子浓度(mmol·l)=-。

(2)

式(2)中：为茶叶抗菌肽处理磷离子浓度，为无菌水处理磷离子浓度。

使用细菌基因组dna提取试剂盒(solarbio)提取金黄色葡萄球菌基因组dna。将1 mg·ml茶叶抗菌肽粗提物(5 μl)与细菌基因组dna(2 500 ng)(5 μl)在室温下孵育30 min。抗菌肽(rlllrigrr-nh)作为阳性对照。加入2 μl上样缓冲液后，利用0.8%琼脂糖凝胶(含eb，终浓度5 μg·l)在120 v电压下进行电泳，电泳后使用凝胶成像系统拍照观察dna的迁移速率。

透射电镜按照klubthawee等的方法进行。取1 ml对数生长期菌液(10cfu·ml)加入100 μl 100 μg·ml的茶叶抗菌肽粗提物，37 ℃温育2 h。离心收集细胞后加入固定液，4 ℃固定2～4 h。pbs漂洗后加入体积分数1%锇酸室温固定2 h。pbs洗涤后在分级乙醇系列中脱水，最后丙酮脱水。将样品分别转移到丙酮和环氧树脂(体积比分别为1∶1和1∶2)混合物中，最后转移到环氧树脂中，37 ℃保存过夜。样品切片用2%醋酸铀饱和乙醇溶液、枸橼酸铅各染色15 min。利用透射电子显微镜ht-7700(日本hitachi)观察茶叶抗菌肽粗提物处理金黄色葡萄球菌后细胞微观结构变化。

冷却肉处理。在超净工作台内将新鲜冷却肉分割成100 g小块，随机分为3组。将分割好的冷却肉分别浸渍在200 ml以下处理液中5 min：①对照组(ck)，无菌水；②100 μg·ml茶叶抗菌肽粗提物；③100 μg·mlnisin。在无菌环境下将各组肉沥干，然后放于灭菌的一次性塑料碗中，置于4 ℃冷柜中保存12 d。每3 d检测各处理组冷却肉微生物生长情况和ph值变化。

ph值测定。在超净工作台内分别将10 g处理组和对照组冷却肉用灭菌的手术剪刀剪碎，置于含有100 ml灭菌水的玻璃瓶内(瓶内预置适量的玻璃珠)，经充分振摇后用灭菌纱布过滤。用ph计测定溶液ph值，每个处理重复3次。依据段静芸等的判定标准评价冷却肉的新鲜度。

微生物生长检测。将25 g冷却肉剪碎放于盛有225 ml pbs的玻璃瓶内(瓶内预置适量玻璃珠)，充分振摇后用灭菌纱布过滤，将滤液制成不同浓度梯度稀释液。将1 ml稀释液加入无菌培养皿内，然后加入15 ml冷却至46 ℃左右的营养肉汁培养基，混匀。pbs作为空白对照。置于37 ℃培养箱内倒置培养48 h，记录菌落数(以lg cfu·g表示)。实验重复3次。依据段静芸等的判定标准评价冷却肉的新鲜度。

使用数据处理系统dps v7.05的单因素方差分析(anova)方法进行数据统计，数据以平均值±标准误表示，并采用duncan’s新复极差法进行差异显著性分析，不同小写字母表示处理间差异显著(