李 芳，刘 霞，黄 政，何应琴，宋勤飞，牛素贞，*

(1.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025；2.贵阳人文科技学院 经济与管理学院，贵州 贵阳 550025)

茶树[(l.) o. kuntze]是中国原始的经济作物，其核心产地在中国西南地区。茶叶从最初的药用发展到现今的饮用经历了数千年的历史，其种植范围和茶文化已遍及世界多个国家和地区，成为世界三大非酒精饮料之一。特异叶色茶树是不同于常规绿色表型茶树的稀有资源，其内含物质与表型绿色的茶树也有很大不同。紫芽茶的独特之处在于其富含花青素类物质，随着花青素的健康功能和医学价值逐渐被阐明，特别在人们生活水平大幅度提高的今天，对生活品质的需求也相应提高。紫芽茶作为茶树新品种，其特色产品的开发利用逐渐受到广泛的关注。

花青素是一类重要的水溶性天然色素，广泛存在于几乎所有植物的根、茎、叶、花与果实中，在分类上属于黄酮类化合物。植物叶片颜色变化的机理在很多研究中已有较成熟的见解，普遍认为花青素类物质是影响叶片颜色变化的主要原因。比如有研究者对栎树叶色变化进行研究，在不同显色特征的叶片里挖掘到影响花青素积累的关键基因、、3、3′、3′5′、、；在对红花玉兰颜色变化的研究中获得花青素合成关键基因3′5′、、；在对野生蕉的紫色和绿色表型的研究中发现花青素合成关键基因4、4、f3h、、、，以及它们的转录因子。说明花青素是影响植物表型紫化的关键因素。

本课题组近年来在贵州境内发现了大量大茶树资源，通过表型与生化组分分析发现，这些资源的遗传多样性丰富，在品质、抗性、产量相关性状上具有很好的优势。p113是前期研究中于黔西南州发现的紫芽茶树新材料，其新梢在不同季节呈现不同程度紫化现象，生长势强，芽叶肥厚且持嫩性较好，分类上属于大厂茶(f. c. zhang)。该材料为乔木，叶片革质，白色花朵，柱头5裂，花朵直径约为5.8 cm，果实为梅花形，子房5室，顶芽无毛，平均叶长14.2 cm，平均叶宽6.8 cm，且叶片随着季节变换新梢呈现出不同程度紫化的现象，形态特征明显区别于当下较出名的育成品种紫娟和紫嫣。叶片颜色变化的机制在茶叶上已有相关研究，但目前还没有提出明确的机制。尤其是p113作为大厂茶，与其他茶组植物基因背景差异较大，其紫化机理的研究尚未见报道，所以对其开展不同季节黄酮类物质积累情况研究，对紫化机理的研究和相关基因挖掘很有必要。

本研究所用材料为大厂茶特异紫化植株p113，提前半年修剪封园，分别于次年3月中旬(春)、5月下旬(夏)、8月上旬(秋)取生长良好、无病虫害的一芽二叶(图1)，微波制干作为试验材料，用于代谢组检测。春、夏、秋分别命名为a、b、c组，试验设计3个生物学重复，每个生物学重复为一个试验样本。

图1 p113茶树在春(a)、夏(b)、秋(c)的生长情况fig.1 growth of p113 tea plant in spring (a)， summer (b) and autumn (c)

1.2.1 试液提取与数据采集

将材料真空冷冻干燥后，用研磨仪(mm 400， retsch)研磨(30 hz， 1.5 min)至粉末状，称取100 mg粉末溶解于0.6 ml提取液中(提取液配方由迈维代谢生物公司提供)，溶解后的样品4 ℃冰箱过夜，期间涡旋6次，提高提取率；10 000×离心 10 min，吸取上清液，用微孔滤膜(0.22 μm)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于uplc-ms/ms分析。

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)(shim-pack uflc shimadzu cbm30a，https：//www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(tandem mass spectrometry，ms/ms)(applied biosystems 4500 qtrap，http：//www.appliedbiosystems.com.cn/)。液相条件主要包括：色谱柱(waters acquity uplc hss t3 c18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm)；流动相中a相为超纯水(加入0.04%的乙酸)，b相为乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脱梯度中0 min b相比例为5%，10 min内b相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，11～11.10 min b相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 ml·min；柱温40 ℃；进样量4 μl。

主要质谱参数：质谱电压为5 500 v，电喷雾离子源温度(esi)为550 ℃，帘气(cur)为30 psi，碰撞诱导电离(cad)为高，去簇电压(dp)与碰撞能(ce)均具体优化。

1.2.2 代谢物定量

代谢物定量采用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring，mrm)分析完成。质控样本(qc)由3个时期9个生物重复样本提取物混合制备而成，在仪器分析过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。利用analyst 1.6.3软件处理质谱数据。

对不同质控qc试验材料质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，结果显示(图2)，代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，说明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好，代谢物提取和检测的重复性也较好。说明试验取材方式合理，样本间重复性较好，可以进行进一步分析。

图2 qc样本质谱检测总离子流图(tic)叠加图fig.2 superposition of total ion current (tic) of qc samples detected by mass spectrometry

季节间与季节内样本pca分析结果(图3)显示，不同季节间的样本在春季、夏季和秋季均表现出了明显的分离，而季节内的3个重复样本之间显示出了较低的变异。第一主成分(pc1)得分67.31%，第二主成分(pc2)得分19.95%，表明该pca模型的质量和可预测性较好，春季、夏季和秋季之间的代谢物含量变异较大，季节内的代谢物含量变异较小，符合试验设计预期效果，可以进行下一步分析。

a、b、c分别代表春、夏、秋各时期的样本。主成分所占比例越大，代表该主成分区分样本的可信度越大。a， b and c represented samples in spring， summer and autumn， respectively. the greater the proportion of principal component， the greater the reliability of the sub sample representing the principal component.图3 主成分分析得分fig.3 score of principal component analysis

p113春季、夏季和秋季的一芽二叶共检测到165个黄酮类化合物离子峰，其中，正离子峰71个、负离子峰94个，分属于12种黄酮类物质(图4)。其中，花青素类物质有矢车菊素3，5--二葡萄糖苷、矢车菊素3--葡萄糖苷、矢车菊素-乙酰基葡萄糖等10种，占比6.06%；双黄酮类物质有3，3′，4′，5，5′，7-六羟基黄烷、(4→8)-3，3′，4′，5，5′，7-六羟基黄烷、(全-r)-构型、3′-脱氧，3′-氧-(3，4，5-三羟基苯甲酰基) 4种，占比2.42%；查尔酮类物质有根皮素1种，占比0.6%；二氢黄酮类物质有圣草次苷、圣草酚、圣草酚-己糖等7种，占比4.24%；二氢黄酮醇类物质有香橙素、二氢杨梅素(蛇葡萄素)、橙皮素-葡萄糖醛酸等5种，占比3.03%；黄烷醇类物质有(-)-儿茶素没食子酸酯、(-)-表阿夫儿茶精、(-)-表没食子儿茶素、(+)-阿夫儿茶精-3-氧-没食子酸酯等16种，占比9.70%；黄酮类物质有5-羟基-6，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、金合欢素-7--葡萄糖醛酸苷、芹菜素-己糖基--芸香糖苷、木犀草素--芸香糖--鼠李糖等44种，占比质26.67%；黄酮碳糖苷类物质有8--己糖苷-芹菜素-己糖苷--己糖苷、芹菜素-6--β--木糖苷-8--β--阿拉伯糖苷、-己糖基-芹菜素-对香豆酰己糖苷等7种，占比4.24%；黄酮醇类物质有6-羟基山奈酚-3，6--二葡萄糖苷-7--葡萄糖醛酸、6-羟基山奈酚-3--芸香糖-6--葡萄糖苷、槲皮素-3--(2″-没食子酰基)-β--葡萄糖苷、异鼠李素-3--芸香糖苷等44种，占比26.67%；异黄酮类物质有阿福豆素、4′，6，7-三羟基异黄酮、根皮苷、李属异黄酮(樱黄素)4种，占比2.42%；原花青素类物质有肉桂单宁b2、表儿茶素表阿夫儿茶精、没食子儿茶素-儿茶素、棕儿茶素a1、原花青素三聚单酯、茶黄素(tf1)等13种，占比7.88%；单宁类物质有7--没食子酰--景天庚酮糖、二没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、四苷醇葡萄糖、茶黄棓灵等10种，占比6.06%。

图4 代谢物占比fig.4 proportion of bolite proportion

2.4.1 不同季节黄酮类物质数量

通过对9个样本的代谢物进行韦恩分析，结果显示(图5)，春季共有161个代谢物，夏季共有164个代谢物，秋季共有161个代谢物；其中156个代谢物在3个季节中共有，春季与夏季有158个代谢物共有，夏季与秋季有160个代谢物共有，春季与秋季有157个代谢物共有；春季有2个特有代谢物为异橙黄酮和3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮，夏季和秋季没有特有代谢物。

a、b和c代表春季、夏季和秋季。不同颜色的圈表示不同季节的代谢物集合，重叠的圈表示不同季节的相同代谢物，数字表示代谢物数量。a， b and c represented spring， summer and autumn. circles of different colors represented the collection of bolites in different seasons， and overlapping circles represented the same bolites in different seasons， and the number indicated the number of bolites.图5 不同季节样本间的韦恩图fig.5 venn diagram between samples in different seasons

165个被检测到的黄酮类代谢物中，飞燕草素3--芸香糖苷、7，8-二羟基-5，6，4′-三甲氧基黄酮、金圣草黄素-己糖基--芸香糖苷、金合欢素-7--葡萄糖醛酸苷这4个物质在春季没有检测到表达；夏季不表达或低表达(未检测到)的物质有(-)-儿茶素没食子酸酯、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、异橙黄酮；秋季不表达或低表达(未检测到)的物质有芹菜素--己糖--鼠李糖--葡萄糖醛酸、异橙黄酮、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、李属异黄酮(樱黄素)，其中，异橙黄酮和3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮在夏、秋季均未检测到。

2.4.2 不同季节黄酮类物质的表达量变化

12种黄酮类物质在不同季节的表达量差异分析发现，花青素类物质含量在春季→夏季→秋季持续显著上调表达；双黄酮类物质含量随季节变化均显著下调表达；查尔酮在春季含量最高，在春季→夏季时显著下调表达，在夏季→秋季时快速下调表达；二氢黄酮类物质含量春季最高，春季→夏季显著下调表达，夏季→秋季显著上调表达；二氢黄酮醇类物质含量随季节变化均显著上调表达；黄烷醇类物质含量随季节变化均下调表达；黄酮类物质和黄酮醇类物质含量在3个季节先上调后下调但整体趋于相对稳定；黄酮碳糖苷类物质在春季→夏季时显著上调，夏季→秋季表达量变化不显著；异黄酮类物质含量在春季→夏季时上调表达，夏季→秋季时下调表达；原花青素类物质含量在春季→夏季时上调表达，夏季→秋季时下调表达；单宁类物质含量在春季最高，春季→夏季下调表达，在夏季→秋季稳定在一定的水平(图6-a)。从图6-b可以看出，黄烷醇和黄酮醇类物质在3个季节的所有样本中都有较高的表达量，其次是黄酮和单宁类物质；查尔酮类物质在3个季节的所有样本中表达量相对其他物质而言是最低的，其次是异黄酮类物质；而花青素和原花青素类物质在3个季节中也有较高的表达量。

图a中所有柱状图的纵坐标表示峰值归一化后的值(fold change)，横坐标a、b、c分别表示春、夏、秋；图b中纵坐标表示代谢物名称，横坐标表示峰值归一化后的值，不同的颜色表示不同的季节。the ordinate of all histograms in figure a represented the normalized value of the peak (fold change)， and the abscissa a， b and c represented spring， summer and autumn， respectively； in figure b， the ordinate represented the bolite name， the abscissa represented the peak normalized value， and different colors represented different seasons.图6 不同季节黄酮类物质的表达量fig.6 of flavonoid in different seasons

2.4.3 黄酮类代谢物间的相关性

对12类黄酮物质进行相关性分析发现(图7)，花青素含量与二氢黄酮醇、黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素类物质含量呈正相关，与双黄酮、查尔酮、二氢黄酮、黄烷醇类、单宁类物质含量呈负相关；双黄酮含量与查尔酮、黄烷醇类、异黄酮、单宁类物质含量呈正相关，与二氢黄酮醇、黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇含量呈负相关；查尔酮含量与黄烷醇、异黄酮、单宁类物质含量呈正相关，与二氢黄酮醇、黄酮碳糖苷含量呈负相关；二氢黄酮含量与黄烷醇、单宁类物质含量呈正相关，与二氢黄酮醇、黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素含量呈负相关；二氢黄酮醇含量与黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素含量呈正相关，与黄烷醇、异黄酮、单宁类物质含量呈负相关；黄烷醇类含量与异黄酮、单宁类物质含量呈正相关，与黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素含量呈负相关；黄酮含量与黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素含量呈正相关，与单宁含量呈负相关；黄酮碳糖苷含量与黄酮醇、原花青素含量呈正相关，与异黄酮、单宁类物质含量呈负相关；黄酮醇含量与原花青素含量呈正相关，与单宁含量呈负相关；原花青素含量与单宁含量呈负相关。

右侧和下侧为代谢物类别名称，左侧和上侧为样本聚类树，左上角图例是不同r值的颜色区间，颜色越红，表示代谢物间的相关性越大，颜色越蓝，表示代谢物间的相关性越小。the right and lower sides were bolite category names， the left and upper sides were sample clustering trees， and the legend in the upper left corner was the color range of different r values. the redder the color， the greater the correlation between bolites， and the bluer the color， the smaller the correlation between bolites.图7 不同类别代谢物之间的相关性热图fig.7 heat map of correlation between different categories of bolites

2.4.4 黄酮类代谢物kegg代谢通路分析

根据kegg(https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)数据库与本研究检测到的黄酮类物质绘制图8，可知花青素类物质代谢位于黄酮类物质代谢途径的下游。自苯丙酸代谢途径的香豆酰辅酶a开始，代谢主要进入2条支路，一条经过查尔酮合成酶生成柚皮素查尔酮，从而进入黄酮和黄酮醇类物质的代谢，另一条经过crtr、chs、f3h等的作用进入花青素代谢途径。花青素中的天竺葵素来自黄酮与黄酮醇支路的下游，而矢车菊素和飞燕草素的底物一部分来自黄酮与黄酮醇途径，一部分由圣草素、二氢槲皮素等作为底物合成。

图8 黄酮类物质代谢路径图fig.8 bolic pathway of flavonoids

茶树叶片颜色的变化是由多种因素共同影响的，是一个复杂的调控网络结构。芽叶呈色主要与叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮3类物质有关，而黄酮类物质(尤其花青素)通常使叶子呈现红色、蓝色或紫色，这与植物细胞液的酸碱性有直接关系；叶绿素通常使植物呈现绿色，而紫茶芽叶中高含量的黄酮类物质与叶绿素产生拮抗关系，在浓度达到一定程度时使叶片颜色由绿色向紫色转变。本研究对大厂茶p113进行黄酮类物质代谢水平的研究，发现黄酮类物质与p113的紫化表型密切相关。

p113的一芽二叶在春季、夏季和秋季之间的黄酮类代谢物含量差异较大，而相同季节内的代谢物含量差异较小，结合3个季节对p113新梢叶色的观察，可以确定黄酮类物质在随季节变换的过程中发生了动态变化；但是也有部分物质只在特定季节里表达，比如飞燕草素3--芸香糖苷、7，8-二羟基-5，6，4′-三甲氧基黄酮、金圣草黄素-己糖基--芸香糖苷、金合欢素-7--葡萄糖醛酸苷只在夏秋季表达，在春季不表达或低表达(未检测到)；(-)-儿茶素没食子酸酯、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、异橙黄酮在春季和秋季均有表达，在夏季不表达或低表达(未检测到)；芹菜素--己糖--鼠李糖--葡萄糖醛酸、异橙黄酮、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮、李属异黄酮(樱黄素)在春夏季均有表达，在秋季不表达或低表达(未检测到)，并且异橙黄酮和3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮只在春季表达。韦恩分析能清晰地展示不同分组形式的共有和特有元素信息，本研究中的165个黄酮类代谢物，有部分物质在季节间的表达有区别，春季有2个代谢物为特有，夏季和秋季没有特有代谢物，但总体上大部分黄酮类代谢物在每一个时期都有表达。对12种黄酮类物质在季节间的变化分析发现，花青素类物质在春季→夏季时显著增加，在夏季→秋季时也在增加，但是趋于平稳，协同变化的物质有二氢黄酮醇、黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、原花青素，说明这些物质协同花青素对叶片的颜色变化起作用；但也有部分物质含量随季节变化呈现持续下降的趋势，与花青素的合成形成了拮抗关系，比如查尔酮类物质。查尔酮是苯丙氨酸代谢途径中转向黄酮类物质代谢过程的关键物质。茶叶中的花青素类物质主要是矢车菊色素、飞燕草色素和天竺葵色素。值得注意的是，花青素中的天竺葵素来自黄酮与黄酮醇支路的下游，而矢车菊素和飞燕草素的底物一部分来自黄酮与黄酮醇途径，一部分由圣草素、二氢槲皮素等作为底物合成，从而使花青素类物质与黄酮和黄酮醇类物质形成底物竞争的关系，最初开始竞争的物质是查尔酮。本研究中查尔酮类物质在春季→夏季时合成相对较高，为花青素的合成奠定物质基础，在秋季下降到很低，但是在秋季花青素的合成已经趋于平稳，虽然查尔酮整体含量在3个季节中都较少，但是对下一步黄酮类物质合成有着至关重要的作用。

综上所述，大厂茶紫化茶树p113在随季节变换的过程中，黄酮类物质含量发生了显著变化，尤其是花青素类物质含量从春季到秋季显著增加，使得p113新梢一芽二叶的颜色随季节变换呈现不同程度的紫化现象。