帕金森病(parkinson's disease, pd)是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病。其主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(dopamine,da)能神经元进行性变性丢失，纹状体区多巴胺含量减少,以及残存的多巴胺能神经元内形成以突触共核蛋白(α-synuclein, α-syn)为主要成分的嗜酸性包涵体—路易小体(lewy body, lb)。

帕金森疾病的治疗目前仍无显著有效的药物，干细胞治疗是诸多方法中很有前景的一种，尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, mscs)。间充质干细胞是一种多功能性细胞，表现出低免疫原性，具有多向分化的同时，还具有免疫调节的生物学潜能，可以离体扩大培养

，根据文献，其对神经系统疾病有一定的治疗作用

。现阶段研究发现，msc的治疗作用主要来源于间充质干细胞旁分泌作用产生的外泌体(exosomes，exo)和可溶性因子，其中外泌体中含有microrna、蛋白质在内的多种物质，可以发挥靶向调节作用

，其能够通过血脑屏障

，在治疗神经疾病方面更有优势。文献显示，间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes, msc-exo)能够到达黑质，显著抑制6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-ohda)诱导的pd大鼠疾病模型

，能够抑制pd小鼠模型的氧化应激

。本文探讨通过尾静脉注射msc-exo对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, mptp)诱导的急性帕金森小鼠模型的治疗作用，从神经元损失到炎性变化以及氧化应激等多方面观察效果。

1.1 实验材料 从西安交通大学实验动物中心购买8～12周的c57bl/6小鼠，适应性饲养一周后进行实验，期间自由饮食饮水，12h∶12h昼夜环境。

1.2 间充质干细胞外泌体的提取鉴定 取小鼠皮下脂肪，剪碎后，用0.1%胶原酶Ⅰ 37℃消化40min，然后 200目滤网过滤后，1000rpm，5min离心，培养液悬浮后，接种培养瓶，培养液为改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium,dmem)+10%优级胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)

。培养至4到6代时，在细胞长至融合后，更换为无血清dmem，继续培养24h，收集上清提取外泌体。首先以300g，10min离心去除细胞以及碎片等，然后取上清2000g，10min离心去除较小的细胞碎片，接着以10000g，30min离心清除凋亡体，最后100000g，70min超速离心沉淀外泌体，所有离心步骤均为4℃处理，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,pbs)重悬外泌体后-80℃保存。采用bca(bicinchoninic acid)法对外泌体进行定量，免疫印迹法检测外泌体标志分子cd63 (1∶1000, abcam, california, usa)和cd81 (1∶1000, abcam, california, usa)的表达。

1.3 mptp诱导小鼠帕金森模型 将45只小鼠分为3组，分别为sham组、pd组和pd+msc-exo组，每组15只，sham组在造模时给予生理盐水，pd组腹腔注射mptp诱导急性pd模型，pd+msc-exo组在pd造模后尾静脉注射给予msc-exo。用mptp(m2690, tokyo chemical industrytci，日本)诱导小鼠急性帕金森模型，mptp用生理盐水溶解，配成2mg/ml试剂，小鼠连续腹腔注射4次mptp，间隔2h，每次按照20mg/kg给药，总剂量是80mg/kg

。2h后，尾静脉给予msc-exo，每只50ug/150ul

。在第4天，14天，30天时取材。

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本文实验中用mptp成功诱发急性帕金森模型，实验发现，c57bl/6小鼠给予mptp连续4次后(2h一次，每次20mg/kg)，小鼠的神经元显著减少，th表达降低，给阿朴吗啡后，pd小鼠的转圈数达到200多以上，出现典型的帕金森症状，同时发现，pd小鼠给予msc-exo后症状显著缓解，转圈数相比pd组显著下降，并且神经元损失减少，th的表达量也明显上升，表明msc-exo对帕金森的治疗具有显著作用，能够保护神经元，改善行为学特性。另外，我们还发现pd小鼠纹状体的炎症因子tnfα、il-1β和氧化应激分子nrf2、keap1的表达显著高于sham组，给予msc-exo后小鼠的这些因子表达显著下降。我们的结果与文献报道的结果一致，有临床试验用自体脂肪msc治疗帕金森病人，发现对运动障碍有一定的治疗效果

，给pd大鼠移植msc同样能够显著减少转圈数，增加th的表达

，关于msc-exo对pd治疗效果的研究目前较少，chen等

发现exos在体内通过血脑屏障到达黑质，能够缓解pd小鼠中阿朴吗啡诱导的不对称旋转，减少黑质多巴胺能神经元的丢失和凋亡，并上调纹状体多巴胺水平，ma等

发现在pd小鼠中，骨髓间充质干细胞的exo通过携带mir-181a-2-3p减轻多巴胺神经元的凋亡，并通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, nox4)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, mapk)通过抑制氧化应激。表明在帕金森疾病状态下，整个纹状体脑区的细胞都处于炎症和应激状态，msc-exo通过整体调控这种失控状态而达到治疗作用，但是具体的作用分子有待进一步研究，后续研究中会用组学等方法确定msc-exo的具体作用物质，以及它的靶向分子，为msc-exo治疗帕金森提供更为具体的证据。

2.3 免疫印迹结果 在第4天，pd组小鼠纹状体的th蛋白表达相比于sham组显著降低(