张颜，孙宝盛，肖贵榜，杨玉能，杨泓涛，李世春，邓位喜*

（1遵义职业技术学院，贵州遵义 563006；2习水县富兴牧业有限公司，贵州遵义 564600）

【研究意义】黔北麻羊是贵州省三大优良地方山羊品种之一，因其独特的生态和经济特征，代表了必要的形态和遗传资源，于2013年获国家农产品地理标志登记保护。黔北麻羊被毛有茶褐色及淡褐色2种，具有背部羊毛呈黑色、腹部羊毛呈草白色的独特特征（罗卫星等，2010；曾琼和史忠辉，2011）。因此，揭示黔北麻羊毛色特征形成机制，对探究及丰富羊毛颜色的形成机理具有重要意义。【前人研究进展】羊毛的毛色差异主要是由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素分布和转运所决定（鲍加荣等，2015；郭跃跃等，2017；薛骥轩等，2019）。黑色素包括真黑色素和褐黑色素，合成于黑色素细胞中的黑素小体（刘海霞等，2021）。黑色素细胞由神经峭细胞通过黑色素前体细胞等分化而成，部分黑色素前体细胞迁移至毛囊中，分化为成熟的黑色素细胞，产生的黑色素融入毛发纤维中而形成黑色羊毛（张汝芝和朱文元，2007）；当黑色素生成受抑制大幅度减少或缺乏时则形成白色羊毛（岳丹等，2021）。黑色素合成的关键信号通路包括mc1r/α-msh、mapk、pi3k/akt及wnt/β-catenin等（赵美娟等，2019；mei et al.，2019），而参与黑色素合成通路的因子主要有酪氨酸酶（tyr）、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrp1）、酪氨酸酶相关蛋白2（tyrp2）（jennifer and david，2007）、黑素皮质素受体1（mc1r）（付冬丽，2013）、α-促黑色素细胞激素（α-msh）和小眼畸形相关转录因子（mitf）等（许冬梅，2017）。其中，mitf是调控黑色素形成关键酶的重要转录因子（白瑞等，2006），而tyr是合成黑色素的关键酶（姜俊兵等，2010）。黑色素合成是tyr催化体内酪氨酸羟化而发生的一系列生化反应（郑会芹，2010；刘海霞等，2021），酪氨酸经tyr催化后生成多巴，多巴再经过一系列反应最终形成黑色素（熊和丽等，2019）。【本研究切入点】为了研究黔北麻羊毛色形成的遗传机制，翁吉梅等（2018）从基因水平分析了与黑色素生成相关的基因多态性，李佳璐（2020）研究证实了大足黑山羊、内蒙古山羊皮肤中的tyr和mitf显著差异表达是造成这2种山羊间黑白毛色差异的主要原因，但至今鲜见从蛋白水平研究黔北麻羊黑白毛色差异分子机制的相关报道。【拟解决的关键问题】对黔北麻羊背部黑色羊毛和腹部白色羊毛的皮肤组织进行蛋白组学分析，以期获得影响其毛色差异的特异性蛋白及其通路，为揭示黔北麻羊特征毛色的形成机制提供参考依据。

从习水县富兴牧业有限公司选取体况相近的1岁黔北麻羊公羊3只，分别采集其背部黑色羊毛下的皮肤组织块和腹部白色羊毛下的皮肤组织块，通过蛋白组学筛选出与这2个部位毛色差异相关的蛋白及其通路。黑色羊毛下的皮肤组织块设为试验组，共3个重复（black-1、black-2和black-3）；白色羊毛下的皮肤组织块设为对照组，共3个重复（white-1、white-2和white-3）。

按照ny 5032—2006《无公害食品 畜禽饲料和饲料添加剂使用准则》对黔北麻羊进行饲养管理。黔北麻羊饲料由富兴牧业有限公司配制提供，其消化能为3.12 mj/kg，由玉米（54.0%）、豆粕（26.0%）、麸皮（11.0%）、70%赖氨酸（0.5%）、磷酸氢钙（0.5%）、石粉（1.0%）、小苏打（1.0%）、食盐（1.0%）及预混料（5.0%）组成。

将3只黔北麻羊背部黑色羊毛和腹部白色羊毛区域的羊毛刮净，暴露皮肤，局部麻醉。在体侧背部的肩胛骨后缘1 cm处取3小块皮肤组织样品，同样在腹部取3小块皮肤组织。以生理盐水冲洗皮肤组织，迅速装入标号的冻存管中，经液氮速冻后转至-80℃冰箱保存备用。

参照夏泽宇（2021）的方法，采用sdt裂解法提取黔北麻羊皮肤组织蛋白，随后进行蛋白定量分析。每个样品取适量蛋白进行胰蛋白酶酶解，再对肽段进行脱盐，肽段冻干后复溶及定量。将标记的肽段等量混合，采用高ph反相肽分离试剂盒进行分级。混合的标记肽段先进行柱平衡，经离心脱盐后梯度洗脱；样品冻干后进行复溶并测定肽段浓度；样品经高效液相色谱分离后以质谱仪进行质谱分析，最后对原始数据进行鉴定及定量分析（蒋少秋，2020）。

1.5.1 蛋白聚类分析对显著差异表达蛋白的定量进行归一化，并对蛋白表达量进行分类，然后生成聚类分析图。

1.5.2 显著差异表达蛋白定量分析以黑色羊毛皮肤组织块为试验组（black）、白色羊毛皮肤组织块为对照组（white），当组间蛋白的相比表达差异倍数（logfold change）＞1.20且＜0.05时为上调表达，当logfold change＜0.83且＜0.05时则为下调表达。然后通过蛋白数据库，从显著差异表达蛋白中筛选出与决定毛色的黑色素相关蛋白。

1.5.3 go功能注释及kegg通路富集分析利用blast2go和kaas分别对组间显著差异表达蛋白进行go功能注释及kegg通路富集分析。

1.5.4 亚细胞定位分析通过cello（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）对组间显著差异表达蛋白进行亚细胞定位分析。

显著差异表达蛋白聚类分析结果（图1）显示，黔北麻羊黑色羊毛试验组的3个重复（black-1、black-2和black-3）和 白 色 羊 毛 对 照 组3个 重 复（white-1、white-2和white-3）间的显著差异表达蛋白可明显区分开，说明筛选结果能代表生物学处理对试验样本的影响，试验数据可靠。

与白色羊毛对照组相比，黑色羊毛试验组有420个显著差异表达蛋白（图2），其中247个呈上调表达（红点）、173个呈下调表达（蓝点）。通过蛋白数据库进一步筛选，结果发现在247个上调蛋白中与形成黑色羊毛的黑色素相关蛋白共有9个，包括与视黄醇相关的表皮视黄醇脱氢酶2（sdr16c5）、视黄醇脱氢酶16（rdh16）和视黄醇饱和酶（retsat），以及角蛋白79（krt79）等（表1）；在173个下调蛋白中，与黑色素相关的蛋白有6个，包括蛋白激酶b（akt）、β抑制蛋白1（arrb1）及分泌型卷曲相关蛋白1（sfrp1）等（表1）。

图1 黔北麻羊黑白羊毛组间显著差异表达蛋白聚类分析结果fig.1 cluster analysis of significantly differential proteins between black and white groups of c.hircus

对420个显著差异表达蛋白进行go功能注释分析，结果（图3）表明这些蛋白主要参与到细胞过程（cellular process）、代谢过程（ bolic process）及生物调节（biological regulation）等25种生物学过程（biological process），还参与结合（binding）、催化活性（catalytic activity）和转运活性（transporter activity）等9种分子功能（molecular function），以及细胞（cell）、细胞区域（cell part）、细胞器（organelle）和细胞膜（membrane）等17种细胞组分（cellular component）。

由于go功能注释分析发现许多显著差异表达蛋白涉及细胞组分，因此进一步对420个显著差异表达蛋白进行亚细胞定位分析，并以饼状图展示各亚细胞器中的显著差异表达蛋白数目及分布比例，结果（图4）显示有159个蛋白定位于细胞质、128个蛋白定位于细胞核及88个蛋白定位于线粒体。

图2 黔北麻羊黑白毛色组间差异表达蛋白的火山分布图fig.2 volcano plot of up-regulated proteins and down-regulated proteins between groups of c.hircus

对420个显著差异表达蛋白进行kegg通路富集分析，结果（图5）表明这些显著差异表达蛋白富集在209条kegg通路上，其中排名前20的通路包括缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解（valine，leucine and isoleucine degradation）、过氧化物酶体（peroxisome）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）、不饱和脂肪酸生物合成（thermogenesis）及丙酸代谢（propanoate bolism）等。

在富集获得的209条kegg通路中，进一步筛选到5条与黑色素生成相关的kegg通路（表2），包括视黄醇代谢（retinol bolism）、黑色素生成（melanogenesis）、丝裂原活化蛋白激酶（mapk）、磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶b（pi3k-akt）和wnt/β-连环蛋白（wnt/β-catenin）通路。

羊毛的颜色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒分布及转运所决定（薛骥轩等，2019）。黑色素细胞产生的黑色素会传递给周围的角质形成细胞进行存储，而角质形成细胞在分化过程中形成角蛋白。崔玉琮等（2017）研究表明，角蛋白家族的角蛋白2可激活羊驼皮肤黑色素细胞中与黑色素合成相关的信号通路，促进黑色素合成。本研究中，与白色羊毛对照组相比，黑色羊毛试验组的角蛋白ktr79表达显著上调，意味着形成角蛋白的角质形成细胞及其中的黑色素增加，故推测ktr79是形成黔北麻羊背部黑色羊毛的重要蛋白之一。此外，黑色羊毛试验组中与视黄酸分化相关的sdr16c5、rdh16和retsat等蛋白也呈显著上调表达趋势。其中，视黄酸与视黄酸受体结合形成复合物，然后与酪氨酸酶基因调控区的视黄酸反应元件结合，上调酪氨酸酶基因表达，从而生成更多的黑色素（何成，2019）。本研究中，与视黄酸分化相关的sdr16c5、rdh16和retsat等蛋白表达上调，通过视黄醇代谢通路增加背部黑色羊毛皮肤的黑色素生成。黑色羊毛试验组的合成蛋白17（stx17）、ras肿瘤基因家族成员（rab9a）、溶酶体相关细胞器复合体1亚基3（bloc1s3）等蛋白明显上调，均有利于促进黑色素的生成。其中，bloc1s3与色素沉着（morgan et al.，2006）、黑素体运输（setty et al.，2007）及黑素体组织（lee et al.，2012）密切相关，基因表达下降会引起小鼠色素沉着减少（starcevic and dell'angelica，2004）。rab9a调节黑素细胞中溶酶体和黑素体的运输（mahanty et al.，2016），而stx17表达上调可促进黑素细胞增殖（pielberg et al.，2008）。

表1 黔北麻羊黑白羊毛组间与黑色素生成相关的显著差异表达蛋白table 1 significantly differential proteins related to melanogenesis between groups of c.hircus

图3 显著差异表达蛋白的go功能注释分析结果fig.3 go functional annotation of significantly differentially proteins

图4 显著差异表达蛋白的亚细胞定位分析结果fig.4 subcellular localization of significantly differential proteins

相反，本研究中黑色羊毛试验组的akt较白色羊毛对照组呈显著下调趋势，也有利于黑色素的生成和黑色羊毛的形成。已有研究表明，当pi3k-akt通路中的akt受抑制时，将会激活糖原合成酶激酶-3β（gsk3β），促使mitf磷酸化，从而增强mitf与酪氨酸酶启动子的结合，促进黑色素生成（khaled et al.，2002）。arrb1可增加酪氨酸酶活性，增加细胞内黑色素的含量（平锋锋等，2017）；其参与的mapk通路能激活黑色素细胞受体，促使mitf上调，加速酪氨酸酶相关蛋白合成，引起黑色素生成增加（wang et al.，2017）。但在本研究中黑色羊毛组的arrb1表达显著下调，故推测黔北麻羊黑色羊毛中的黑色素并非主要依靠mapk信号通路形成。值得注意的是，黑色羊毛试验组中的sfrp1表达也呈下调趋势。sfrp1会抑制wnt/β-catenin信号通路活性（郑枫芸和李继承，2007），而wnt/β-catenin信号通路通过上调mitf活性（邹道佩，2019）或激活pi3kakt信号通路刺激黑色素生成（mei et al.，2019）。本研究中，黑色羊毛试验组的sfrp1表达显著下调，对wnt/β-catenin信号通路的抑制作用降低，而有利于黔北麻羊背部黑色羊毛黑色素的生成。

图5 显著差异表达蛋白的kegg通路富集分析结果（前20名）fig.5 kegg pathway enrichment of significantly differential proteins（top 20）

表2 与黑色素生成相关的kegg通路table 2 kegg pathway analysis of significantly differential proteins related to melanin production

β-catenin增强基因表达、刺激黑色素生成的过程均在细胞核内完成（huang et al.，2011；guo et al.，2012）。本研究的go功能注释分析和亚细胞定位结果也显示，在420个显著差异表达蛋白中有128个蛋白定位于细胞核，另有88个蛋白定位于线粒体，进一步证实线粒体在维持皮肤黑素细胞功能和色素沉着方面也具有重要作用（ni-komatsu and orlow，2007）。本研究从蛋白水平上解释了黔北麻羊黑白毛色差异的原因，为山羊毛色形成机制的研究打下了基础，也为推进黔北麻羊特色种质资源的开发利用提供了新思路。

导致黔北麻羊存在黑白毛色差异的原因：一方面是参与黑色素生成通路的krt79及参与视黄醇通路的sdr16c5、rdh16和retsat等蛋白表达上调，促进黑色素细胞中黑色素的生成和黑色羊毛的形成；另一方面是参与pi3k-akt通路的akt表达下调，以及sfrp1表达下调而降低对wnt/β-catenin信号通路的抑制，均有利于黑色素生成。