王逸群，高登科,2，赵泓淙,2，李 丹，马白荣，刘盼盼，孙乐桐，靳亚平,2，陈华涛,2*

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室，陕西杨凌 712100）

为适应因地球自转而形成的光暗循环，生物体从分子、细胞到组织、器官水平的生命活动均存在一定的周期性变化，称为生物节律。生物钟是生物体产生和调节生物节律的内源性振荡器，以24 h 为周期节律性调控机体大量生理功能。生物钟广泛存在于从原核生物到哺乳动物的生物体内。生物钟与新陈代谢、细胞生长增殖等众多生理功能的调控密切相关。当生物钟受到环境、基因突变等因素干扰时，机体的生理过程会发生紊乱，从而导致多种疾病发生。哺乳动物生物钟系统具有复杂的结构，由存在于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，scn）的中枢生物钟和遍布于机体各个器官与组织的外周生物钟构成。中枢生物钟scn 整合光线明暗变化的周期性信号，并通过神经和体液途径调节外周生物钟的节律性振荡，从而维持机体的生理稳态。哺乳动物主要的生物钟基因包括：昼夜运动输出周期蛋白基因（circadian locomotor output cycles kaput，）、脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1 基因（brain and muscle arnt-like protein 1，）、周期生物钟蛋白基因（periods，）、隐花色素生物钟蛋白基因（cryptochromes，）、d 位白蛋白启动子结合蛋白基因（d site albumin promoter binding protein，）、核受体亚家族1 d 组成员1 基因（nuclear receptor subfamily 1 group d member 1，）、维甲酸相关孤儿受体a 基因（rar related orphan receptor a，）等，这些生物钟基因在机体各个组织中通过转录翻译构成了多个相互关联的正负反馈环路，并以此为基础调控众多钟控基因的节律性表达，在机体昼夜节律性振荡维持过程中发挥重要作用。

核受体nr1d1 又被称为rev-erb，是哺乳动物生物钟系统的重要组分，其作为一种转录抑制因子，参与调控机体多项生理功能。nr1d1 可与基因启动子区的ror 反应元件（ror response elements，rore）结合，通过招募辅阻遏子核受体协同抑制因子1（nuclear receptor corepressor 1，ncor1）和组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，hdac3）来抑制核心生物钟基因的转录，nr1d1 还可与等多个生物钟基因相互作用，维持生物钟系统的昼夜节律性振荡。除了作为生物钟系统的核心组分外，nr1d1 还参与机体多个生理过程的调控。例如，参与线粒体呼吸和细胞氧化还原平衡的代谢物血红素被证明是nr1d1 的内源性配体。因此，nr1d1 可作为一种细胞代谢的传感器，将生物钟与代谢联系起来。同时，nr1d1 还可通过抑制炎性因子产生、调节生理周期等方式，参与调控机体免疫、生殖等多个生理过程。

山羊是一种具有重要经济价值的反刍动物，如何调控山羊的生长繁殖进程来提高该物种的生产性能一直是畜牧兽医领域的研究重点。近年来，小鼠的研究证据表明基因参与调控哺乳动物的生长繁殖，但目前仍未见关于山羊基因克隆及其生物学功能预测的报道。基因在山羊全身不同组织中的作用以及对山羊生理功能的调控机制目前尚不清楚。因此，本研究旨在克隆山羊核受体基因的编码序列（coding sequence，cds）并构建其真核表达载体，以期为后续研究山羊nr1d1 的生物学功能提供前期基础。

1.1 细胞及主要试剂 关中奶山羊卵巢组织购自杨凌杨沛屠宰场。trizol、primerstargxl dna polymerase、quick cuth i 均购自日本takara 公司，反转录试剂盒购自ag 生物工程有限公司，sybrpremix ex taq ii 购自日本toyobo 公司，大肠杆菌dh5感受态细胞、无内毒素质粒中量小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，clonexpressii one step cloning kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，hek293t 细胞购自中国科学院细胞库，胎牛血清、opti-mem 培养基均购自美国gibco 公司，dmem 高糖培养基购自hyclone 公司，turbofect transfection reagent 购自美国thermofisher 公司，hrp 标记的鼠抗-actin 抗体购自中国三箭公司，hrp 共轭羊抗兔抗体购自中国中杉金桥公司，ecl hrp 底物试剂盒购自北京迪宁生物科技有限公司。

1.2 引物的设计与合成 根据ncbi 数据库中山羊基因（登录号：xm_018065020.1）的cds 区，使用primer premier 5.0 软件设计pcr 扩增引物。引物上、下游的5' 端分别添加了与pcdna3.1-puro-n-3ha载体h i 酶切位点互补配对的同源序列，引物序列为：f：5'-agagaattcgatatcggatccatgacgac cctggactctaaca-3'；r：5'-ggtctcgagggtac cggatcctcactgggcgtccacccggaag-3'（下划线部分为h i 酶切位点）。引物由西安擎科生物科技有限责任公司合成。

1.3 山羊卵巢组织总rna 的提取及cdna 的合成 采用trizol 法提取山羊卵巢组织总rna，反转录合成cdna，反应体系10 μl：5×prime rt master mix 2.0 μl、total rna 2.5 μl（500 ng）、ddho 5.5 μl。反应程序：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃保存。

1.4 山羊基因cds 区pcr 扩增 以cdna 为模板，扩增山羊基因带有同源臂的cds 区片段。pcr 反应体系50 μl：cdna 4 μl（50 ng/μl）、10 μmol/l 上下游引物各1 μl、2×quick taq hs dye 25 μl，加ddho 至50 μl。pcr 反应程序：98 ℃预变性5 min，98℃变性10 s、55℃退火15 s、72℃延伸115 s，循环35 次，72℃总延伸5 min。对pcr 阳性产物进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收。

1.5 山羊基因真核表达载体的构建及鉴定 使用限制性内切酶h i 对空载体pcdna3.1-puro-n-3ha进行单酶切。将目的片段与线性化的真核表达载体进行重组连接，反应体系20 μl：线性化载体0.03 pmol、插入片段0.06 pmol、exnase ii 2 μl、5×ce ii buffer 4 μl、ddho 加至20 μl，37℃条件下反应15 min。将重组产物转化大肠杆菌dh5感受态细胞，涂板培养后挑取单克隆菌落摇床培养12 h，提取质粒。对重组质粒进行单酶切和pcr 鉴定，结果符合预期后，将重组质粒送至西安擎科生物有限公司测序，将测序正确的重组载体命名为pcdna3.1-3ha-g。

1.6 细胞培养与转染 复苏hek293t 细胞，培养24 h 后，将状态良好的细胞分别传至1 个6 孔板和6 个60 mm细胞培养皿中，将6 孔板和60 mm 细胞培养皿中的细胞同时各分为2 组：转染pcdna3.1-3ha-g组（实验组）和转染空质粒pcdna3.1-puro-n-3ha 组（对照组）。待细胞密度达60% 左右时，转染空载体质粒和重组质粒至hek293t 细胞。6 孔板中，实验组和对照组各转染3 孔，转染24 h 后收样，用于检测山羊基因在mrna 水平的表达；6 个60 mm 细胞培养皿中，实验组和对照组各转染3 皿，转染48 h 后收样，用于检测山羊基因在蛋白水平的表达。

1.7 实时荧光定量pcr 检测基因在mrna 水平的表达 根据ncbi 数据库中山羊和人基因的cds 区，使用primer premier 5.0 设计能同时扩增山羊和人基因cds 区的实时荧光定量pcr（qpcr）引物，同时将人基因作为内参基因，qpcr 引物信息见表1。提取实验组及对照组细胞的总rna，反转录合成cdna 进行qpcr，检测基因在mrna 水平的表达。qpcr 反应体系20 μl：cdna 5 μl（5 ng/μl），premix ex taq ii 10 μl，上、下游引物（10 μmol/l）各1 μl，ddho 补足体系。qpcr 反应程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40 个循环；95℃ 15 s，60℃ 15 s，95.5℃ 5 s。使用cfx96 荧光定量pcr 仪进行检测，采用2相对定量法将ct 值转化为基因相对表达量。

表1 qpcr 引物序列

1.8 western blotting 检测nr1d1 在蛋白水平的表达利用ripa 裂解液提取实验组和对照组细胞的蛋白，使用bca 法测定蛋白浓度后加入适量上样缓冲液，100℃沸水煮10 min。进行sds-page 凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转印至pvdf 膜上，利用10% 脱脂奶粉，室温封闭2 h。加入兔抗ha 一抗工作液（1:5 000 稀释），摇床上缓慢摇动室温孵育2 h。使用预先配置好的tbst 洗涤液洗膜4 次，每次5 min。将pvdf 膜置于hrp 标记的羊抗兔二抗工作液（1:10 000 稀释）中，摇床上室温孵育2 h，洗膜4 次。将膜置于ecl 发光液中，作用2 min，于暗室中进行曝光显影。将曝光后的膜取出，洗膜4 次。加入适量的抗体洗脱液，室温孵育15 min 左右后弃去洗脱液，洗膜3 次。之后移至含有10%脱脂奶粉的平皿中，室温封闭2 h，洗膜4 次。将pvdf 膜置于hrp 标记的-actin 抗体工作液（1:5 000稀释）中，于摇床上室温孵育2 h，之后洗膜4 次。最后将膜置于ecl 发光液中，作用2 min 后，于暗室中进行曝光显影。

1.9 生物信息学分析 利用megalign、mega6、pymol与singalp5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp）、tmhmm server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/）、protparam（https：//web.expay.org/protp aram/）、protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）、sopma（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/）等生物信息学软件，结合ncbi数据库中山羊及其他多个物种的基因序列信息，进行同源性分析，构建系统进化树；同时对山羊nr1d1 蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、二级和三级结构等生物学信息进行预测分析。

1.10 数据统计分析 通过graphpad prism 6.0 软件使用检验对实验组及对照组基因的mrna 相对表达量进行统计学分析，＜0.05 表示具有统计学差异。

2.1 山羊基因cds 区的成功克隆 对pcr 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，经pcr扩增后获得与预期大小（1 893 bp，基因cds区长度1 851 bp，同源臂42 bp）一致的特异性条带（图1），扩增片段单一、明亮，且无非特异性扩增，表明成功获得山羊基因的cds 区片段。

图1 山羊nr1d1 基因pcr 产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.2 重组载体pcdna3.1-3ha-gnr1d1 的成功构建 对重组载体和空载体进行单酶切，凝胶电泳结果如图2 所示，重组载体pcdna3.1-3ha-gnr1d1 单酶切后获得大小约为5 211 bp 和1 851 bp 的2 个条带，与空载体单酶切产物条带和nr1d1 基因pcr 扩增产物条带大小一致。对重组载体pcdna3.1-3ha-gnr1d1 进行测序分析，其中基因cds 区的测序结果与ncbi 库中预测序列（xm_018065020.1）完全一致。上述结果表明，pcdna3.1-3ha-gnr1d1 真核表达载体构建成功。

图2 pcdna3.1-3ha-gnr1d1 真核表达载体酶切鉴定

2.3 qpcr 检测基因在mrna 水平的表达 提取实验组和对照组hek293t 细胞的总rna，反转录合成cdna，进行qpcr 反应。qpcr 结果如图3a 显示，与对照组相比，pcdna3.1-3ha-g转染组的mrna 表达量升高约680 倍（＜0.001）。上述结果表明，pcdna3.1-3ha-g转染组在mrna 水平成功实现山羊基因的过表达。

2.4 western blotting 检测基因在蛋白水平的表达 提取实验组和对照组hek293t 细胞的总蛋白，经western blotting 检测，结果如图3b 所示，用ha 抗体孵育后，pcdna3.1-3ha-g转染组在72 kda 处出现1 条明显的条带，与预期大小相符，而对照组在目的蛋白位置无条带。上述结果表明，pcdna3.1-3hag转染组nr1d1 蛋白在hek293t 细胞中成功过表达。

图3 山羊nr1d1 基因在pcdna3.1-3ha-gnr1d1转染组的表达效率

2.5 生物信息学分析

2.5.1 基因序列分析及系统进化树构建 利用megalign及mega6 将山羊基因cds 区与其他物种的基因cds 区进行同源性比对，并构建系统进化树。同源性比对结果如图4 所示，山羊基因cds 区与绵羊相似性最高（99.6%），其次为牛（98.2%）和猪（95.1%），与斑马鱼相似性最低（65.1%）。系统进化树结果显示，山羊基因与绵羊处于同一小分支，亲缘关系最近，而与斑马鱼亲缘关系最远（图5）。

图4 nr1d1 基因cds 区同源性比对

图5 nr1d1 基因cds 区遗传进化树分析

2.5.2 蛋白理化性质预测 应用protparam 在线软件对山羊nr1d1 蛋白理化性质进行分析，nr1d1 蛋白的氨基酸组成如表2 所示，山羊nr1d1 蛋白分子式为chnos，共包含氨基酸616 个，原子总数为9 268，分子量约为67.012 ku，理论等电点为8.75，总平均亲水性（gravy）为-0.496。不稳定系数64.82，为不稳定蛋白。应用protscale 在线软件对山羊nr1d1 蛋白氨基酸序列的亲水性进行预测，结果显示，最低分值（-2.822）位于第214 位氨基酸，表明亲水性最强；最高分值（2.633）位于第544 位氨基酸，表明疏水性最强；且该蛋白大部分位于亲水区域，故山羊nr1d1 蛋白为亲水性蛋白（图6）。

表2 山羊nr1d1 蛋白氨基酸组成

图6 山羊nr1d1 蛋白亲水性预测

2.5.3 蛋白跨膜结构及信号肽预测 应用tmhmm server v.2.0 对山羊nr1d1 蛋白跨膜结构进行预测，结果显示，山羊nr1d1 蛋白不含跨膜区。应用singalp 5.0对山羊nr1d1 蛋白进行信号肽预测，结果显示，山羊nr1d1 蛋白不含信号肽。

2.5.4 蛋白二级结构预测 应用sopma 在线软件对山羊nr1d1 蛋白的二级结构进行预测，结果显示，山羊nr1d1 蛋白中-螺旋、延伸链、-转角和无规则卷曲所占比例分别为26.62%、12.50%、6.17% 和54.71%，说明山羊nr1d1蛋白二级结构以无规则卷曲为主（图7）。

图7 山羊nr1d1 蛋白二级结构预测

2.5.5 蛋白三级结构预测及比对 应用在线软件swissmodel 预测山羊、小鼠和人nr1d1 蛋白的三级结构，结果如图8 所示。使用pymol 对预测模型进行比较，结果显示，山羊与小鼠nr1d1 蛋白模型间原子位置均方根偏差（root-mean-square deviation，rmsd）为0.538，与人nr1d1 蛋白模型的rmsd 为0.727，说明山羊nr1d1 蛋白与小鼠和人之间的差异较小。

图8 山羊、小鼠、人nr1d1 蛋白三级结构预测及比较

生物钟存在于哺乳动物几乎所有的细胞、组织和器官中，协同调控哺乳动物的大量行为、生理过程与昼夜明暗循环相适应。随着人们对生物钟系统研究和理解的不断深入，生物钟在哺乳动物各项生理过程中发挥的作用及其调控机制受到越来越多的关注。生物钟紊乱可能引发严重的睡眠障碍、肥胖、心血管疾病、代谢疾病、免疫功能障碍及癌症等多种疾病，且有证据表明，、等生物钟基因的缺失会严重影响小鼠的生殖能力。

核受体基因于1989 年被发现定位于编码甲状腺激素受体基因的反向链。的转录受clock/bmal1 所形成异源二聚体的驱动而激活，随后nr1d1 蛋白又反过来与启动子中顺式作用元件rore 结合来抑制基因转录，进而实现对下游生物钟基因（）、（）和大量钟控基因转录的调控。作为一种转录抑制因子，在机体的生物钟系统以及内分泌、生殖、免疫等多个系统中发挥重要的调节作用。近年来，人们更多地关注到基因与包括心血管疾病、炎症、代谢紊乱和癌症在内的多种疾病存在密切的联系。许多研究证据表明，在多种疾病的发展过程中，的节律性表达发生紊乱。基因缺失小鼠昼夜节律紊乱，代谢平衡破坏，且表现出行为异常，包括多动症及学习记忆能力受损等。还有研究发现，nr1d1 激动剂sr9009 和sr9011 给药会改变小鼠黑暗条件下的昼夜节律行为和核心生物钟基因（等）的节律性表达，且能够增加能量消耗并降低脂肪含量、血浆甘油三酯和胆固醇水平，提示通过激动剂调控nr1d1 的活性可能有助于治疗睡眠障碍和代谢疾病。同时，sr9009 和sr9011 对自噬和脂肪从头合成的调控在引发恶性细胞凋亡的反应中具有关键作用，说明对生物钟系统的药理学调节可能是对抗癌症的有效治疗策略。上述证据表明，nr1d1 作为一种重要的生物钟系统组分，在机体的生理稳态调控中起着重要作用，探究它的生理功能和作用机制，或可为多种疾病的治疗提供新思路和靶点。

作为一种具有重要经济价值的反刍动物，山羊在我国养殖历史久、分布范围广。已有模式动物的研究证据表明，哺乳动物生物钟系统在调控生殖与代谢等生理过程中发挥重要作用。然而，目前关于生物钟的研究大多集中于大鼠、小鼠等啮齿类动物，关于山羊生物钟的研究则相对较少。如能进一步深入探究生物钟系统在山羊繁殖与代谢过程中所发挥的具体作用及其调控机制，可以更好地服务于生产实践。xiao 等研究发现生物钟基因通过调节类固醇激素合成关键酶基因的转录，参与调控山羊睾丸间质细胞睾酮的合成，提供了生物钟影响山羊生殖过程的证据。zhang 等证实了山羊皮肤中存在生物钟，且生物钟系统可调节内蒙古白绒山羊毛囊的生长周期。gao等研究发现，山羊生物钟基因可能在调控山羊瘤胃上皮细胞增殖、短链脂肪酸转运及脂质代谢方面发挥作用。上述证据表明，生物钟基因在山羊生长繁殖的调控过程中发挥重要作用，但目前仍未见有关生物钟基因调控山羊各项生理过程的研究报道。山羊基因位于19 号染色体，包含8 个外显子，cds区全长1 851 bp，共编码616 个氨基酸。基于前期研究基础，本研究成功克隆了山羊基因的cds 区并构建了真核表达载体，将重组质粒转染至hek293t 细胞后，验证了在mrna 和蛋白水平的过表达。上述研究证据提示，山羊nr1d1 可能在反刍动物细胞昼夜节律性振荡的维持和各项生理过程中发挥重要作用，但具体的作用机制尚需进一步的试验研究。

本研究成功构建了pcdna3.1-3ha-g真核表达载体，并在mrna 和蛋白水平验证了山羊基因在hek293t 细胞的表达效率。同时，本研究对山羊基因及其蛋白进行了深入的生物信息学分析，结果表明，山羊基因cds 区与绵羊、牛等反刍动物有较高的相似性，山羊nr1d1 蛋白为不稳定蛋白，不含跨膜区和信号肽，三级结构与人和小鼠nr1d1 蛋白较为相似。本研究为后续进一步探究山羊基因的生物学功能提供了前期基础。