陈治徽，陈 林，张力莉，刁其玉，李胜利，毕研亮*，徐晓锋*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.中国农业科学院饲料研究所，奶牛营养学北京市重点实验室反刍动物及其幼畜营养代谢中美联合研究中心，北京 100081；3.中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

随着畜牧业规模化、集约化的发展，早期断奶技术得到广泛应用。早期断奶可减少代乳粉和牛奶的使用，降低犊牛饲养成本，并且可以有效刺激犊牛提前适应固体饲料，加快犊牛瘤胃的发育，从而为后期取得良好的生产性能奠定基础。但早期断奶产生的应激不仅会对犊牛健康、生长发育和免疫机能产生影响，也会对犊牛后期的生产性能产生较大影响。犊牛断奶应激往往伴随着生理指标和组织器官结构改变，而血液成分的相对稳定和肠道黏膜屏障的完整与健康是保证其犊牛生长和后期高生产的基础。目前大多数研究主要集中于犊牛断奶应激发生原因和如何缓解犊牛断奶应急，但关于由断奶应激引起的犊牛断奶前后血液生化及肠道通透性变化规律的研究甚少。本试验旨在研究犊牛断奶前后其血液生化和肠道通透性的变化规律，进一步解释断奶应激的形成，为生产实践提供理论基础。

1.1 试验设计 试验于2019 年5—10 月在宁夏某牧场开展。选择健康、体重相近的50 日龄荷斯坦母犊牛12 头，采用大圈饲养。试验期31 d，（断奶前7 d，断奶后21 d）。试验开始后每日早晚各饲喂代乳粉1 次，采用自由饮水和自由采食开食料，犊牛60 日龄断奶。开食料组成及营养成分见表1。

表1 开食料组成及营养成分（干物质基础）

1.2 样品采集 分别在断奶前2 d 及断奶后1、2、3 周通过颈静脉采血10 ml 采集12 头断奶犊牛血液，置于肝素钠采血管中，3 000 r/min 离心15 min，吸取上清液，-20℃冰箱内保存。

1.3 血液中应激和免疫及生化指标测定 血清葡萄糖（glu）、尿素氮（bun）、总蛋白（tp）、白蛋白（alb）、球蛋白（glb）、总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、碱性磷酸酶（alp）、天门冬氨酸氨基转移酶（ast）均采用迈瑞bs-180 全自动生化分析仪测定，试剂盒均为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。血液白细胞介素-1（il-1）、toll 样受体4（tlr4）、结合珠蛋白（hp）采用江苏晶美生物科技有限公司的elisa试剂盒，利用酶标仪（tecan infinite f50）测定。

1.4 肠道通透性指标测定 闭锁小带蛋白-1（zo-1）、乳酸（d-la）、二胺氧化酶（dao），采用江苏晶美生物科技有限公司的elisa 试剂盒，利用酶标仪（tecan infinite f50）测定。

1.5 统计分析 利用 excel 对数据进行初步整理，用sas 8.2 软件进行统计分析，若差异显著则利用duncan's 法进行多重分析。数据用平均值±标准误表示，＜0.05 表示差异显著，＜0.01 表示差异极显著。

2.1 犊牛断奶后血液生化指标和免疫指标的变化规律 由表2 可知，断奶后3 周glu 高于断奶后1、2 周（＜0.01），但低于断奶前2 d（＜0.01）；断奶前2 d 犊牛bun、tc、tg 含量高于断奶后1、2、3 周（＜0.01），alp 含量高于断奶后1 周（＜0.01），而断奶前2 d 犊牛血液tp、glb、ast 含量低于断奶后1、2、3 周（＜0.01），断奶后3 周alp 含量高于断奶前2 天（＜0.01）。断奶前2 d 犊牛血液il-1含量低于断奶后1、2、3 周（＜0.01），hp 含量低于断奶后1、2、3 周（＜0.05），而tlr4含量则低于断奶后3 周（＜0.05）。

表2 犊牛断奶后血液生化指标和免疫指标的变化规律

2.2 犊牛断奶后肠道通透性指标变化规律 由表3 可知，犊牛断奶后1 周血液zo-1 略有升高（＞0.05），断奶后1、2 周d-la 相较于断奶前2 d 有上升趋势（＞0.05），而断奶后3 周犊牛血液dao 含量高于断奶前2 d（＜0.01）

表3 犊牛断奶后肠道通透性指标变化规律

3.1 犊牛断奶后血液生化指标和免疫指标的变化规律glu 是动物体内各组织细胞活动的能量来源，glu 浓度主要受胰岛素及胰高血糖素调节，当glu 浓度过低时刺激胰高血糖素等激素分泌并会启动糖异生途径来维持glu 恒定。本试验结果显示，60 日龄断奶会降低犊牛glu 浓度，且断奶后1、2、3 周glu 浓度极显著低于断奶前2 d。周玉香、赵会利研究结果也显示，早期断奶应激会引起glu 含量和胰岛素水平降低，bun 含量和胰高血糖素水平显著升高，犊牛断奶之前其营养来源主要是通过摄入牛奶中易于消化吸收的蛋白质、游离氨基酸、脂肪和乳糖等，而断奶后犊牛摄入的开食料、全价料和饲草等只能提供碳源和氮源的化合物，需要经过瘤胃的发酵、降解等来合成犊牛自身所需的营养物质，这也使得犊牛在断奶后肠道结构发生变化，进而导致肠道对营养物质的吸收能力下降。断奶后从小肠中吸收的营养物质含量迅速减少，蛋白摄入量不能满足糖异生，从而降低了葡萄糖含量，使glu 无法保持相对稳定。有研究表明，glu 浓度随着犊牛年龄增长和瘤胃功能的发展而降低。glu 浓度过低还会导致大脑中葡萄糖供应不足而出现功能失调，影响犊牛健康和日增重等。

bun 是评价动物机体氨基酸和蛋白质代谢平衡状态的一项重要指标。正常情况下bun 浓度较低，表明动物机体氨基酸代谢正常，机体蛋白质合成率较高。本试验中，60 日龄断奶增加了bun 浓度，断奶后1、2、3 周bun 浓度均极显著高于断奶前2 d，表明断奶应激导致犊牛体蛋白大量分解，犊牛肝脏还未完全适应能量供应由乳糖转变为瘤胃挥发性脂肪酸的方式。血液tp 浓度可体现机体免疫力以及代谢水平，提高其浓度有利于提高机体免疫力和代谢水平。本试验中，犊牛断奶后血液tp、glb 浓度极显著高于断奶前2 d，并随日龄的增加逐渐增加，表明断奶后犊牛随着日龄的增加代谢水平和免疫力逐渐提高。

断奶应激会通过内部和外部感受器同时刺激动物下丘脑-垂体-肾上腺轴（hpa）引起交感神经兴奋，引发下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素（crh）与血管增压素（vp）协同调控肾上腺皮质分泌糖皮质激素。本试验中血液tc 极显著降低表明犊牛应激时tc利用提高，机体对断奶应激的反应强烈。全炳昭等在研究早期断奶应激对仔猪的影响时发现，tc 与早期断奶应激呈负相关。tg 水平可直接反映脂肪消化吸收的状态。本试验中，犊牛断奶后血液tg 浓度极显著低于断奶前2 d，其原因可能是断奶应激引起机体能量需求增加，而应激影响了脂类物质在胃肠组织中的消化吸收，因此机体通过增加脂肪动员来增加能量来源，此外肝外组织对类脂的需要量增加，导致断奶后血液tg 浓度极显著低于断奶前2 d。随着断奶后犊牛日龄增加，tg 的浓度也随之增加，但断奶后3 周tg 浓度仍低于断奶前2 d，表明本试验中犊牛的断奶应激还在持续，研究时间应该延长。

alp 主要在动物肝脏、肾脏、骨骼和肠道等组织分布，是通过肝脏向胆外排出，因此alp 的活性也能反映动物的生长状况，可作为骨骼生长的标记物。有研究显示，alp 有降低肠道炎症反应和病原菌易感性等作用，肠道中alp 的活性与肠道内养分有效性和供应量有关联。本试验中，犊牛断奶后1 周血液alp含量极显著低于断奶前2 d，但断奶后2 周恢复到正常水平，表明断奶后1 周犊牛生长健康受到的影响较大。

tlr4 是一类天然免疫受体，也是参与适应性免疫的重要蛋白，可以在t 细胞、b 细胞、单核细胞和自然杀伤（nk）细胞表达，也是连接固有免疫和适应性免疫的重要桥梁。长期慢性应激可激活tlr4 基因表达量显著升高，进而可能导致严重的炎症反应和慢性疾病。本试验中，断奶后3 周犊牛血液tlr4 受体显著高于断奶前2 d，而断奶后1、2 周比断奶前2 d 也有升高趋势，表明tlr4 引发的炎症反应可能长期存在于动物体内并损伤动物机体的健康。张千等研究断奶应激对幼龄反刍动物免疫系统的影响及机理时指出，断奶后炎症可能会长期存在于动物体内并对动物的健康造成损害。

il-1是激活tlr4 的主要促炎因子，il-1与机体免疫系统密切相关，且具有改变神经内分泌等多方面的功能。也有研究表明，il-1是一个潜在的应激诱导炎症反应的调节因子，可以刺激肝脏急性蛋白合成，增强机体炎症反应，造成组织损伤。本试验中，断奶后1、2、3 周犊牛血液il-1基因表达量均极显著高于断奶前2 d，表明断奶犊牛机体可能产生了强烈的炎症反应和免疫应答。当机体长时间存在炎症因子或炎症反应时，机体会消耗大量能量物质以促进免疫系统消除炎症（因子）反应，这也使得动物的生产性能受到影响。

hp 是与游离血红蛋白（hb）结合形成hp-hb 复合物的载体蛋白，其作用是将hb 转用至肝脏中进行代谢。本试验中，断奶后1、2、3 周犊牛血液基因表达量显著高于断奶前2 d，可能是因为断奶应激使得犊牛血液蛋白发生改变，激活了单核巨噬细胞中的核因子b（nf-b），使其进入核内与许多细胞因子以及炎症介质基因5'端调控区的b 序列发生结合并启动该基因进行转录，导致血液hp 含量升高。

3.2 犊牛断奶后肠道通透性指标的变化规律 zo-1 主要存在于肠道、血管内皮等组织器官中，是上皮细胞紧密连接重要结构蛋白的组成成分，zo-1 与众多组织上皮细胞的紧密连接相关蛋白相互作用。本试验中，犊牛在断奶后1 周血液中zo-1 略有升高，这表明断奶应激会对犊牛肠道、血管内皮等组织产生影响，但不明显。d-la 是肠道内众多固有细菌可以产生的代谢物，但d-la 在其他组织中均不产生和代谢，然而当肠道屏障受损时，肠道细菌产生大量的d-la 就会透过受损肠道屏障进入血循环，增加血液中d-la 含量，因此d-la 含量的高低可作为肠道健康状况和肠道屏障功能是否受损的一项重要指标。本试验中，犊牛在断奶前2 d 和断奶1、2、3 周血液中d-la 含量存在上升趋势，但未发生显著性变化，这表明由牛奶转变为开食料这一过程中犊牛肠道屏障会受到损伤。dao 是一种含有脱胺的腐胺和组胺的细胞内酶，肠道黏膜是其存在的主要部位，正常机体血液中的含量极少。dao 活性也是反映小肠功能的一项重要指标，正常情况下血液中dao趋于稳定，但当小肠黏膜绒毛上皮细胞损伤时，血清中dao 水平会急剧增高，因此测定血中dao 活性可反映肠屏障黏膜损伤和修复的情况。本试验结果表明，犊牛断奶前2 d 及断奶后1、2 周血清中dao 含量有增加趋势，并在断奶3 周后显著增加，这也印证了断奶应激会引发肠道黏膜受损，改变肠道通透性。断奶应激引起的犊牛肠道黏膜损伤可能会随着时间的延长持续存在，仍需进一步研究。

本试验结果表明，犊牛断奶后1、2、3 周血液中glu、tc、tc 的浓度低于断奶前2 d，bun 含量升高，这表明断奶应激使得犊牛营养和能量摄入不足，增加自身脂肪动员和体蛋白分解，从而影响其自身对营养物质的代谢；断奶后1 周血液中alp 浓度显著低于断奶前2 d，断奶后trl、il-1b 和hp 浓度均显著高于断奶前2 d，表明犊牛会因断奶应激而引发机体炎症反应，影响犊牛内分泌系统和免疫系统；断奶应激也会造成d-la、dao 水平上升，表明犊牛断奶应激会造成肠道屏障受损，进而对其肠道通透性产生影响。